外异蛋白A基因TNF编码区突变检测的引物组、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种外异蛋白a基因tnf编码区突变检测的引物组、试剂盒，以及试剂盒的应用。
背景技术：
：先天性牙发育不全是一种牙齿发育缺陷的遗传性疾病，通常在牙胚形成中恒牙未能发育和形成。它分为非综合征型缺牙(non-syndromichypodontia，nsh，omim号为313500)和综合征型缺牙(syndromichypodontia，sh，omim号为305100)，前者表现为单纯缺牙，后者缺牙并伴随毛发稀少、汗腺少等。先天性牙发育不全会严重影响患者的咀嚼、发音、颜面美观、身心发育及心理健康。外异蛋白a(ectodysplasin-a，eda)基因的突变是导致非综合征型缺牙和综合征型缺牙的决定性因素，eda基因(nm_001399)位于x染色体的长臂上(xq12-13.1)，有9个外显子，基因大小为425kb，经过拼接产生不同的构型，最长可编码391个氨基酸，称为eda-a1，属于伴x隐性遗传。eda蛋白形成三聚体，被弗林蛋白酶(furin)酶切之后分泌到细胞外，与三聚体膜蛋白eda受体(edareceptor，edar)一对一结合，激活下游相关信号如nfκb等，影响外胚层发育。其中，编码tnf结构域的核酸序列如seqidno.1所示，由外显子7、8、9组成，tnf结构域可以与eda受体(edareceptor,edar)相互作用。eda基因tnf编码区的突变会引起eda蛋白结构变化，进而影响与edar相互作用及edar下游信号分子的激活，造成不同程度外胚层发育不全。通过在不同数据库，包括hgmd(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、uniport(http://www.uniprot.org)和ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索eda、omim号313500及305100等统计发现，到目前为止，已报道导致先天性非综合征型缺牙和综合征型缺牙的eda基因突变已超过200例，突变位点分布于eda蛋白的各个结构域，但大部分突变位点集中在tnf编码区，在导致氨基酸残基发生改变但没有改变开放阅读框orf长度的100例错义突变中，共有64例突变发生在tnf编码区，且tnf结构域的不同的位点的突变可以导致不同的缺牙表型，如表1所列出，均为已报道的、可导致缺牙表型的突变。通过naccess软件(http://www.bioinf.manchester.ac.uk/naccess/)计算tnf结构域氨基酸的相对溶剂可及性(relativesolventaccessibility，rsa)的值发现，导致非综合型缺牙的突变氨基酸位点侧链平均rsa值绝大多数大于8，而导致综合型缺牙的突变氨基酸位点侧链平均rsa值绝大多数小于8。因此，当tnf结构域的氨基酸位点侧链平均rsa值大于8时，突变导致的缺牙表型倾向于非综合型缺牙；而当tnf结构域的氨基酸位点侧链平均rsa值小于8时，突变导致的缺牙表型倾向于综合型缺牙。通过对eda蛋白tnf结构域所有氨基酸位点进行侧链平均rsa值计算并预测其可能导致的缺牙表型得到表2。目前还没有一种检测人群样本的外异蛋白a基因tnf编码区突变、并根据基因突变判断表型的方法，因此建立检测外异蛋白a基因tnf编码区突变的方法及检测和预测突变可能导致的表型迫在眉睫。技术实现要素：本发明提供了一种检测外异蛋白a基因tnf编码区核酸序列的特异性引物，以及包含该引物的检测外异蛋白a基因tnf编码区突变的试剂盒，以及检测外异蛋白a基因tnf编码区突变的方法，以及特异性引物和试剂盒在检测外异蛋白a基因tnf编码区突变中的应用。本发明提供了三对特异性引物用于扩增外异蛋白a基因tnf编码区核酸序列，通过将扩增得到的外异蛋白a基因tnf编码区核酸序列与该基因的序列进行比对，判断外异蛋白a基因tnf编码区核酸序列是否发生突变，并判断该基因突变可能引发的牙发育表型改变；并进一步根据计算氨基酸残基的侧链平均rsa值，判断综合征缺牙或者非综合征缺牙表型。本发明结果准确可靠、特异性强、灵敏度高、意义重大。为了实现上述目的，按照本
发明内容的一个方面，提供了一种用于检测外异蛋白a基因tnf编码区突变的引物组，该基因外显子7的引物碱基序列为seqidno.1和seqidno.2所示的序列；该基因外显子8的引物碱基序列为seqidno.3和seqidno.4所示的序列；该基因外显子9的引物碱基序列为seqidno.5和seqidno.6所示的序列。按照本
发明内容的另一个方面，提供了一种包含所述引物用于检测外异蛋白a基因tnf编码区突变的试剂盒。优选地，试剂盒还包括利用引物组中的引物进行pcr反应的试剂；提取基因组dna的试剂；阳性对照；阴性对照。优选地，pcr反应的试剂包括引物、taqdna聚合酶、dntp；阳性对照为连接有eda基因7号外显子的t载体即t-7质粒、连接有eda基因8号外显子的t载体即t-8质粒、接有eda基因9号外显子的t载体即t-9质粒，阴性对照为空白t载体。按照本
发明内容的另一个方面，提供了一种用于检测外异蛋白a基因tnf编码区突变的方法，所述方法包括以seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6为引物进行目的基因扩增的步骤。优选地，所述目的基因扩增以外异蛋白a基因tnf编码区外显子7、外显子8、外显子9的核酸序列为靶序列。外异蛋白a基因的genbank登录号为nm_001399。按照本
发明内容的另一个方面，所述的引物组在检测外异蛋白a基因tnf编码区突变中的应用。按照本
发明内容的另一个方面，所述的试剂盒在检测外异蛋白a基因tnf编码区突变中的应用。本发明首次开发一种简捷、操作简便的检测方法及检测试剂盒，包括引物组和试剂组、检测方法以及缺牙表型判断方法，其中引物组涉及到eda基因的tnf编码区，能快速获取该关键区域的核苷酸序列情况，明确突变位点，并根据突变位点检索、预测突变导致的表型。该方法的有益效果是：(1)建立了pcr体系，可扩增并检测人eda基因7、8、9号外显子是否发生突变；(2)引物组在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带；(3)样本检测范围广，多种来源的基因组dna样本，如人外周血、人体培养细胞、人体组织细胞、人口腔拭子等提取而得的基因组dna；(4)操作简便，检测廉价；(5)检测过程简捷，只需经过pcr扩增再测序即可，检测特异性强、灵敏度高，结果准确；(6)建立了判断方法，来预测突变可能导致的缺牙表型。附图说明图1是eda基因7、8、9号外显子pcr扩增产物阳性对照电泳图；图2是待测样本a外显子7核酸序列与seqidno.7序列比对；图3是待测样本a外显子8核酸序列与seqidno.8序列比对；图4是待测样本a外显子9核酸序列与seqidno.9序列比对；图5是待测样本b外显子7核酸序列与seqidno.7序列比对；图6是待测样本b外显子8核酸序列与seqidno.8序列比对；图7是待测样本b外显子9核酸序列与seqidno.9序列比对；图8是待测样本b外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列与seqidno.11序列比对；图9是待测样本c外显子7核酸序列与seqidno.7序列比对；图10是待测样本c外显子8核酸序列与seqidno.8序列比对；图11是待测样本c外显子9核酸序列与seqidno.9序列比对；图12是待测样本c外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列与seqidno.11序列比对；图13是待测样本d外显子7核酸序列与seqidno.7序列比对；图14是待测样本d外显子8核酸序列与seqidno.8序列比对；图15是待测样本d外显子9核酸序列与seqidno.9序列比对图16是待测样本d外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列与seqidno.11序列比对；图17是待测样本e外显子7核酸序列与seqidno.7序列比对；图18是待测样本e外显子8核酸序列与seqidno.8序列比对；图19是待测样本e外显子9核酸序列与seqidno.9序列比对；图20是待测样本e外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列与seqidno.11序列比对；图21是待测样本f外显子7核酸序列与seqidno.7序列比对；图22是待测样本f外显子8核酸序列与seqidno.8序列比对；图23是待测样本f外显子9核酸序列与seqidno.9序列比对；图24是待测样本f外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列与seqidno.11序列比对。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。在不脱离本发明上述技术思想和所公开精神的情况下，根据本领域普通技术知识与惯用手段，做出各种等效、替换、修改或变更，都落入本发明保护的范围。本发明的引物组涉及到组成eda基因tnf编码区的7、8、9号外显子，外显子7的引物exon7f的核苷酸序列如seqidno.1所示；外显子7的引物exon7r的核苷酸序列如seqidno.2所示；外显子8的引物exon8f的核苷酸序列如seqidno.3所示；外显子8的引物exon8r的核苷酸序列如seqidno.4所示；外显子9的引物exon9f的核苷酸序列如seqidno.5所示；外显子9的引物exon9r的核苷酸序列如seqidno.6所示。本发明的引物组分别用于扩增eda基因的7、8、9外显子，然后将扩增的目标片段进行测序，以获得扩增的目标片段中的tnf编码区序列信息，并将tnf编码区序列翻译为对应的tnf结构域氨基酸序列后，并由此判定tnf结构域氨基酸序列是否发生突变，对于检测发现的基因突变，再根据本方案表1和表2中突变对应的牙发育类型，判定该基因突变导致的牙发育不全表型。具体判定方法如下：1、对于未发生碱基插入或缺失、未发生错义突变的样本，即扩增出的eda基因7、8、9外显子未发生任何突变、与野生型序列完全一致的样本，不会产生由eda基因tnf编码区突变造成的缺牙。2、对于碱基插入或缺失造成阅读框架发生改变的突变，可判定为综合征缺牙表型。3、对于翻译出的tnf结构域氨基酸序列提前终止或延长的错义突变，即无义突变或终止密码突变，则可判定为综合征缺牙表型。4、对于阅读框架未发生改变、且氨基酸序列未提前终止或延长的错义突变，对照文献已经报道的eda蛋白tnf结构域错义突变列表，即表1，判定是否为已知突变。(1)若翻译出的tnf结构域氨基酸序列为表1中的已知突变，则可根据该已知突变导致的缺牙表型，判定样本中基因突变可导致的缺牙表型；(2)若翻译出的tnf结构域氨基酸序列发生错义突变，且该错义突变未在表1中列出，即为未知错义突变，则需要通过检索表2，对eda蛋白tnf结构域未知突变的表型进行预测。表型预测的依据为，对于rsa值大于8的氨基酸发生错义突变，可判定为非综合征缺牙表型；对于rsa值小于8的氨基酸发生错义突变，可判定为综合征缺牙表型。(3)对于表2中部分已经报道的错义突变的位点，如果根据rsa值推断出的缺牙表型与同一位点已知错义突变的表型不一致，则以同一位点已知错义突变的缺牙表型作为判断依据。本发明的引物组涉及到eda基因的tnf编码区，能快速获取该关键区域的核苷酸序列情况，明确突变位点，本说明书中所述“突变”可以是一个或多个碱基的插入、取代和/或缺失；且该引物组在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带。本发明试剂盒包括引物组和试剂组、检测方法以及缺牙表型判断方法，具有准确、灵敏度高、特异性强等优势。此方法在eda基因tnf编码区突变导致的先天性牙发育不全的表型检测中具有非常高的实际应用价值。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。实施例1以待测样本a人体外周血基因组dna为模板，利用7、8、9号外显子的3对引物进行pcr反应，扩增产物进行测序，利用序列比对软件mega7，将测序结果与野生型eda基因7、8、9外显子编码区序列seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9分别进行比对，或者将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，与野生型eda基因tnf编码区序列seqidno.10进行比对，确定是否突变及具体的突变位点。更进一步的，将上述测序结果sequence1，sequence2，sequence3共3个序列进行拼接，得到待测样本的外显子7、8、9的连续序列，并翻译为氨基酸序列，与eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，确定eda蛋白tnf结构域是否发生突变，并确定待测样本是否发生突变及突变可能导致的缺牙表型。(1)样本基因组dna的提取：使用商品化的全血基因组dna提取试剂盒(qiagen公司qiaampdnabloodmidikit)提取全血基因组dna，具体操作步骤如下：a)往15ml离心管管底加入100微升qiagen蛋白酶，并加入1ml全血。注：全血体积不足1ml时，pbs补齐1ml。b)加入1.2mlal缓冲液，充分混匀，震荡器上斡旋震荡至少一分钟，使溶液成为均相溶液。c)70℃水浴锅温育10分钟，加入1ml无水乙醇，充分震荡。d)转移液体至吸附柱中，3000rpm离心3分钟，拿出吸附柱，倾倒滤液，将吸附柱重新放回15ml离心管中。e)小心加入aw1缓冲液至吸附柱中，5000rpm离心1分钟。f)加入2mlaw2缓冲液至吸附柱中，5000rpm离心15分钟。g)将吸附柱转移至一新的15ml离心管中，弃去装有滤液的收集管。h)加入200微升ae洗脱液，室温静置5分钟，5000rpm离心2分钟。i)将获得的基因组dna经紫外分光光度计检测提取质量(od260/od280为1.8-2.0)，并确定其含量。(2)基因扩增：利用上述引物，以获得的基因组为模板，按如下的pcr体系进行基因扩增得到含有7号外显子的产物：试剂实验组阳性对照阴性对照2xtaqmix10μl10μl10μldntp1μl1μl1μlprimerexon7f(10μm)1μl1μl1μlprimerexon7r(10μm)1μl1μl1μl模板(0.1-1μg)基因组dnat-7质粒空白t载体补水至20μl20μl20μl为得到含有8号外显子的产物，需将primerexon7f和primerexon7r替换为特异性引物primerexon8f和primerexon8r，阳性对照则需替换为t-8质粒，其它条件不变。为得到含有9号外显子的产物，需将primerexon7f和primerexon7r替换为特异性引物primerexon9f和primerexon9r，阳性对照则需替换为t-9质粒，其它条件不变。扩增的条件为：95℃预变性5min，再进行35个循环，循环条件为95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。得到的pcr产物进行凝胶电泳，结果如图1所示。(3)测序分析：分别对得到的pcr产物进行测序，再将测序结果分别与外显子7序列(即seqidno.7)，外显子8序列(即seqidno.8)，外显子9序列(即seqidno.9)进行比对，如下所示：a)7号外显子序列比对：sequence1表示用seqidno.1和seqidno.2为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon7为eda基因7号外显子野生型序列即seqidno.7。由比对结果可知，待测样本外显子7核酸序列与seqidno.7序列100％一致，如图2所示，左边一列为待测样本外显子7核酸序列，右边一列为seqidno.7序列，即测样本外显子7未发生突变。b)8号外显子序列比对：sequence2表示用seqidno.3和seqidno.4为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon8为eda基因8号外显子野生型序列即seqidno.8。由比对结果可知，待测样本外显子8核酸序列与seqidno.8序列100％一致，如图3所示，左边一列为待测样本外显子8核酸序列，右边一列为seqidno.8序列，即测样本外显子8未发生突变。c)9号外显子序列比对：sequence3表示用seqidno.5和seqidno.6为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon9为eda基因9号外显子野生型序列即seqidno.9。由比对结果可知，待测样本外显子9核酸序列与seqidno.9序列100％一致，如图4a、图4b、图4c所示，各图左边一列为待测样本外显子9核酸序列，右边一列为seqidno.9序列，即测样本外显子9未发生突变。(4)结果分析：由序列比对结果可知，待测样本的eda基因外显子7、8、9与野生型eda基因tnf编码区序列100％一致，即待测样本eda基因tnf编码区未发生突变，不会产生由eda基因tnf编码区突变造成的缺牙。实施例2以待测样本b人体培养细胞基因组dna为模板，设计针对其7、8、9号外显子的3对引物，经过pcr反应后进行测序，利用序列比对软件，将测序结果与野生型eda基因7、8、9外显子编码区序列seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9分别进行比对，或者将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，与野生型eda基因tnf编码区序列seqidno.10进行比对，确定是否突变及突变位点。更进一步的，将上述测序结果sequence1，sequence2，sequence3共3个序列进行拼接，得到待测样本的外显子7、8、9的连续序列，并翻译为氨基酸序列，与eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，确定eda基因的tnf编码区是否发生突变，并确定待测是否发生突变及突变可能导致的缺牙表型。(1)样本基因组dna的提取：使用商品化的培养细胞基因组dna提取试剂盒(qiagen公司blood&cellculturednamidi)提取培养细胞基因组dna，具体操作步骤如说明书所述。(2)基因扩增方法同实施例1中(2)。(3)测序分析：分别对得到的pcr产物进行测序，再将测序结果分别与外显子7序列(即seqidno.7)，外显子8序列(即seqidno.8)，外显子9序列(即seqidno.9)进行比对，如下所示：a)7号外显子序列比对：sequence1表示用seqidno.1和seqidno.2为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon7为eda基因7号外显子野生型序列即seqidno.7。由比对结果可知，待测样本外显子7核酸序列与seqidno.7序列100％一致，如图5所示，左边一列为待测样本外显子7核酸序列，右边一列为seqidno.7序列，即测样本外显子7未发生突变。b)8号外显子序列比对：sequence2表示用seqidno.3和seqidno.4为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon8为eda基因8号外显子野生型序列即seqidno.8。由比对结果可知，由比对结果可知，由图6a、图6b所示，各图左边一列为待测样本外显子8核酸序列，右边一列为seqidno.8序列，待测样本外显子8核酸序列有一位碱基发生了突变，碱基t被删除(如黑框所示)，即测样本外显子8发生了突变。c)9号外显子序列比对：sequence3表示用seqidno.5和seqidno.6为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon9为eda基因9号外显子野生型序列即seqidno.9。由比对结果可知，由图7a、图7b、图7c所示，各图左边一列为待测样本外显子9核酸序列，右边一列为seqidno.9序列，待测样本外显子9核酸序列与seqidno.9序列100％一致，即测样本外显子9未发生突变。(4)结果分析：由序列比对结果可知，待测样本的eda基因外显子7、9与野生型eda基因tnf编码区序列100％一致，但待测样本外显子8核酸序列有一位碱基发生了突变，t被删除。将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，并翻译成氨基酸序列，与野生型eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，如图8a、图8b所示：sequence表示将3个测序结果中外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列，tnf表示eda蛋白tnf结构域序列即seqidno.11。由图8a、图8b可知，各图左边一列为待测样本7、8、9外显子拼接后翻译成氨基酸序列，右边一列为eda蛋白tnf结构域序列即seqidno.11，对比发现待测样本7、8、9外显子编码的氨基酸序列在第21位即eda蛋白tnf结构域第270位(如黑框所示)发生移码突变即p.val270glyfs，待测样本第21-142位即tnf结构域氨基酸270-391位全部突变。(5)表型预测：eda蛋白tnf结构域氨基酸为p.250-p.391，此待测样本eda基因tnf编码区缺失突变c.809delt导致了氨基酸序列移码突变即p.val270glyfs，第279位氨基酸为终止密码子，且p.270-p.391基本均产生突变，可导致综合征缺牙表型。实施例3以待测样本c人体外周血基因组dna为模板，设计针对其7、8、9号外显子的3对引物，经过pcr反应后进行测序，利用序列比对软件，将测序结果与野生型eda基因tnf结构域7、8、9外显子编码区序列seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9分别进行比对，或者将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，与野生型eda基因tnf编码区序列seqidno.10进行比对，确定是否突变及突变位点。更进一步的，将上述测序结果sequence1，sequence2，sequence3共3个序列进行拼接，得到待测样本的外显子7、8、9的连续序列，并翻译为氨基酸序列，与eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，确定eda基因的tnf编码区是否发生突变，并确定待测是否发生突变及突变可能导致的缺牙表型。(1)样本基因组dna的提取：使用商品化的人体外周血基因组dna提取试剂盒(qiagen公司qiaampdnabloodmidikit)提取基因组dna，具体操作步骤如说明书所述。(2)基因扩增方法同实施例1中(2)。(3)测序分析：分别对得到的pcr产物进行测序，再将测序结果分别与外显子7序列(即seqidno.7)，外显子8序列(即seqidno.8)，外显子9序列(即seqidno.9)进行比对，如下所示：a)7号外显子序列比对：sequence1表示用seqidno.1和seqidno.2为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon7为eda基因7号外显子野生型序列即seqidno.7。由比对结果可知，由图9所示，左边一列为待测样本外显子7核酸序列，右边一列为seqidno.7序列，待测样本外显子7核酸序列有一位碱基发生了突变，由t变为g(如黑框所示)，即测样本外显子7发生了突变。b)8号外显子序列比对：sequence2表示用seqidno.3和seqidno.4为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon8为eda基因8号外显子野生型序列即seqidno.8。由比对结果可知，由图10a、图10b所示，各图左边一列为待测样本外显子8核酸序列，右边一列为seqidno.8序列，待测样本外显子8核酸序列与seqidno.8序列100％一致，即测样本外显子8未发生突变。c)9号外显子序列比对：sequence3表示用seqidno.5和seqidno.6为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon9为eda基因9号外显子野生型序列即seqidno.9。由比对结果可知，由图11a、图11b、图11c所示，各图左边一列为待测样本外显子9核酸序列，右边一列为seqidno.9序列，待测样本外显子9核酸序列与seqidno.9序列100％一致，即测样本外显子9未发生突变。(4)结果分析：由序列比对结果可知，待测样本的eda基因外显子8、9与野生型eda基因tnf编码区序列100％一致，但待测样本外显子7核酸序列有一位碱基发生了突变，由t变为g，即测样本外显子7发生了突变。将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，并翻译成氨基酸序列，与野生型eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，如下所示：sequence表示将3个测序结果中外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列，tnf表示eda蛋白tnf结构域序列即seqidno.11。由图12a、图12b所示，各图左边一列表示外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列，右边一列表示seqidno.11，比对结果可知，待测样本7、8、9外显子编码的氨基酸序列上发生了突变，在第11位即eda蛋白tnf域第260位由ile变为ser(如黑框所示)，即待测样本的tnf结构域氨基酸发生了突变p.260i>s。通过检索表1可知，此突变已被发现，即突变c.779t>g。(5)表型预测：野生型eda蛋白tnf结构域氨基酸为p.250-p.391，通过检索表1，可知该待测样本的突变已经被发现报道，即外异蛋白a第260位氨基酸由ile变为ser，可导致非综合征缺牙表型。据此可知，待测样品eda基因tnf结构域发生突变c.779t>g即p.260i>s，该突变可导致非综合征缺牙表型。实施例4以待测样本d人体组织基因组dna为模板，设计针对其7、8、9号外显子的3对引物，经过pcr反应后进行测序，利用序列比对软件，将测序结果与野生型eda基因tnf结构域7、8、9外显子编码区序列seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9分别进行比对，或者将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，与野生型eda基因tnf编码区序列seqidno.10进行比对，确定是否突变及突变位点。更进一步的，将上述测序结果sequence1，sequence2，sequence3共3个序列进行拼接，得到待测样本的外显子7、8、9的连续序列，并翻译为氨基酸序列，与eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，确定eda蛋白tnf结构域是否发生突变，并确定待测是否发生突变及突变可能导致的缺牙表型。(1)样本基因组dna的提取：使用商品化的组织基因组dna提取试剂盒(qiagen公司qiaampdnaffpetissuekit)提取组织基因组dna，具体操作步骤如说明书所述。(2)基因扩增方法同实施例1中(2)。(3)测序分析：分别对得到的pcr产物进行测序，再将测序结果分别与外显子7序列(即seqidno.7)，外显子8序列(即seqidno.8)，外显子9序列(即seqidno.9)进行比对，如下所示：a)7号外显子序列比对：sequence1表示用seqidno.1和seqidno.2为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon7为eda基因7号外显子野生型序列即seqidno.7。由比对结果可知，由图13所示，左边一列为待测样本外显子7核酸序列，右边一列为seqidno.7序列，待测样本外显子7核酸序列与seqidno.7序列100％一致，即测样本外显子7未发生突变。b)8号外显子序列比对：sequence2表示用seqidno.3和seqidno.4为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon8为eda基因8号外显子野生型序列即seqidno.8。由比对结果可知，由图14a、图14b所示，各图左边一列为待测样本外显子8核酸序列，右边一列为seqidno.8序列，待测样本外显子8核酸序列与seqidno.8序列100％一致，即测样本外显子8未发生突变。c)9号外显子序列比对：sequence3表示用seqidno.5和seqidno.6为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon9为eda基因9号外显子野生型序列即seqidno.9。由比对结果可知，如图15a、图15b所示，各图左边一列为待测样本外显子9核酸序列，右边一列为seqidno.9序列，待测样本外显子9核酸序列有一位碱基发生了突变，由t变为c(如黑框所示)，即测样本外显子9发生了突变。(4)结果分析：由序列比对结果可知，待测样本的eda基因外显子7、8与野生型eda基因tnf编码区序列100％一致，但待测样本外显子9核酸序列有一位碱基发生了突变，由t变为c，即测样本外显子9发生了突变。将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，并翻译成氨基酸序列，与野生型eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，如图16a、图16b所示：sequence表示将3个测序结果中外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列，tnf表示eda蛋白tnf结构域序列即seqidno.11。由图16a、图16b所示，各图左边一列表示外显子7、8、9部分拼接后翻译的氨基酸序列，右边一列表示seqidno.11，对比发现待测样本7、8、9外显子编码的氨基酸序列上发生了突变，在第105位即eda蛋白tnf域第354位由leu变为pro(如黑框所示)，即待测样本tnf结构域的氨基酸发生了突变p.354l>p。通过检索表1可知，此突变已被发现，即突变c.1061t>c。(5)表型预测：野生型eda蛋白tnf结构域氨基酸为p.250-p.391，通过检索表1，可知该待测样本的突变已经被发现报道，即外异蛋白a第354位氨基酸由leu变为pro，可导致综合征缺牙表型。据此可知，待测样品eda基因tnf结构域发生突变c.1061t>c即p.354l>p，该突变可导致综合征缺牙表型。实施例5以待测样本e人外周血基因组dna为模板，设计针对其7、8、9号外显子的3对引物，经过pcr反应后进行测序，利用序列比对软件，将测序结果与野生型eda基因tnf结构域7、8、9外显子编码区序列seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9分别进行比对，或者将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，与野生型eda基因tnf编码区序列seqidno.10进行比对，确定是否突变及突变位点。更进一步的，将上述测序结果sequence1，sequence2，sequence3共3个序列进行拼接，得到待测样本的外显子7、8、9的连续序列，并翻译为氨基酸序列，与eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，确定eda基因的tnf编码区是否发生突变，并确定待测是否发生突变及突变可能导致的缺牙表型。(1)样本基因组dna的提取：使用商品化的人外周血基因组dna提取试剂盒(qiagen公司qiaampdnabloodmidikit)提取人基因组dna，具体操作步骤如说明书所述。(2)基因扩增方法同实施例1中(2)。(3)测序分析：分别对得到的pcr产物进行测序，再将测序结果分别与外显子7序列(即seqidno.7)，外显子8序列(即seqidno.8)，外显子9序列(即seqidno.9)进行比对，如下所示：a)7号外显子序列比对：sequence1表示用seqidno.1和seqidno.2为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon7为eda基因7号外显子野生型序列即seqidno.7。由比对结果可知，如图17所示，左边一列为待测样本外显子7核酸序列，右边一列为seqidno.7序列，待测样本外显子7核酸序列与seqidno.7序列100％一致，即测样本外显子7未发生突变。b)8号外显子序列比对：sequence2表示用seqidno.3和seqidno.4为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon8为eda基因8号外显子野生型序列即seqidno.8。由比对结果可知，如图18a、图18b所示，各图左边一列为待测样本外显子9核酸序列，右边一列为seqidno.9序列，待测样本外显子8核酸序列与seqidno.8序列100％一致，即测样本外显子8未发生突变。c)9号外显子序列比对：sequence3表示用seqidno.5和seqidno.6为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon9为eda基因9号外显子野生型序列即seqidno.9。由比对结果可知，如图19a、图19b、图19c所示，各图左边一列为待测样本外显子9核酸序列，右边一列为seqidno.9序列，由比对结果可知，待测样本外显子9核酸序列有一位碱基发生了突变，由c变为t(如黑框所示)，即测样本外显子9发生了突变。(4)结果分析：由序列比对结果可知，待测样本的eda基因外显子7、8与野生型eda基因tnf编码区序列100％一致，但待测样本外显子9核酸序列有一位碱基发生了突变，由c变为t，即测样本外显子9发生了突变。将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，并翻译成氨基酸序列，与野生型eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，如图20a、图20b所示：sequence表示将3个测序结果中外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列，tnf表示eda蛋白tnf结构域序列即seqidno.11。由比对结果可知，由图20a、图20b所示，各图左边一列表示外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列，右边一列表示seqidno.11，对比发现待测样本7、8、9外显子编码的氨基酸序列上发生了突变，在第109位即eda蛋白tnf域第358位由gln变为终止密码子(如黑框所示)，即待测样本tnf结构域的氨基酸发生了突变p.358q>*。通过检索表1可知，此突变已被发现，即突变c.1072c>t(5)表型预测：eda-a1tnf结构域氨基酸为p.250-p.391，通过检索表1，可知该突变已经被发现报道，即外异蛋白a第358位氨基酸由gln变为终止密码子，可导致综合征缺牙表型。据此可知，待测样品eda基因tnf结构域发生突变c.1072c>t即p.358q>*，该突变可导致综合征缺牙表型。但需要注意的是，如果突变并未提前终止氨基酸翻译，如同一位点已报道的突变c.1072c>g即p.358q>e，则可导致非综合征缺牙表型。实施例6以待测样本f人口腔拭子基因组dna为模板，设计针对其7、8、9号外显子的3对引物，经过pcr反应后进行测序，利用序列比对软件，将测序结果与编码eda基因tnf结构域的野生型7、8、9外显子区序列seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9分别进行比对，或者将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，与野生型eda基因tnf编码区序列seqidno.10进行比对，确定是否突变及突变位点。更进一步的，将上述测序结果sequence1，sequence2，sequence3共3个序列进行拼接，得到待测样本的外显子7、8、9的连续序列，并翻译为氨基酸序列，与eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，确定eda蛋白tnf结构域是否发生突变，并确定待测是否发生突变及突变可能导致的缺牙表型。(1)样本基因组dna的提取：使用商品化的人口腔拭子基因组dna提取试剂盒(qiagen公司qiaamp96dnaswabbiorobotkit)提取人口腔基因组dna，具体操作步骤如说明书所述。(2)基因扩增方法同实施例1中(2)。(3)测序分析：分别对得到的pcr产物进行测序，再将测序结果分别与外显子7序列(即seqidno.7)，外显子8序列(即seqidno.8)，外显子9序列(即seqidno.9)进行比对，如下所示：a)7号外显子序列比对：sequence1表示用seqidno.1和seqidno.2为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon7为eda基因7号外显子野生型序列即seqidno.7。由比对结果可知，由图21所示，左边一列为待测样本外显子7核酸序列，右边一列为seqidno.7序列，待测样本外显子7核酸序列与seqidno.7序列100％一致，即测样本外显子7未发生突变。b)8号外显子序列比对：sequence2表示用seqidno.3和seqidno.4为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon8为eda基因8号外显子野生型序列即seqidno.8。由比对结果可知，由比对结果可知，由图22a、图22b所示，各图左边一列为待测样本外显子8核酸序列，右边一列为seqidno.8序列，待测样本外显子8核酸序列有一位碱基发生了突变，由g变为c(如黑框所示)，即测样本外显子8发生了突变。c)9号外显子序列比对：sequence3表示用seqidno.5和seqidno.6为引物对进行pcr得到的产物的测序结果，exon9为eda基因9号外显子野生型序列即seqidno.9。由比对结果可知，由图23a、图23b、图23c所示，各图左边一列为待测样本外显子9核酸序列，右边一列为seqidno.9序列，待测样本外显子9核酸序列与seqidno.9序列100％一致，即测样本外显子9未发生突变。(4)结果分析：由序列比对结果可知，待测样本的eda基因外显子7、9与野生型eda基因tnf编码区序列100％一致，但待测样本外显子8核酸序列有一位碱基发生了突变，g变为c，即测样本外显子8发生了突变。将测序结果中外显子7、8、9部分拼接，并翻译成氨基酸序列，与野生型eda蛋白tnf结构域氨基酸序列seqidno.11进行比对，如图24a、图24b所示：sequence表示将3个测序结果中外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列，tnf表示eda蛋白tnf结构域序列即seqidno.11。由比对结果可知，由图24a、图24b所示，各图左边一列为外显子7、8、9部分拼接后翻译成氨基酸后的序列，右边一列为seqidno.11，对比发现待测样本7、8、9外显子编码的氨基酸序列上发生了突变，在第49位即eda蛋白tnf结构域第298位由asp变为his(如黑框所示)，即待测样本编码的tnf结构域氨基酸发生了突变p.298d>h。通过检索表1可知，此突变已被发现，即突变c.892g>c(5)表型预测：野生型eda蛋白tnf结构域氨基酸为p.250-p.391，通过检索表1，可知该待测样本的突变已经被发现报道，即外异蛋白a第298位氨基酸由asp变为his，可导致综合征缺牙表型。但需要注意的是，如果直接查找表2，可知该位点氨基酸突变侧链平均rsa值为53.43，该值大于8，理论上可导致的表型为非综合征缺牙。针对以上情况，即对于表1中已报道的突变造成的表型与表2中理论预测可导致的表型不同的情况，以表1中已报道的可突变可造成的表型为准。因此，对于此突变，eda基因tnf结构域发生突变c.892g>c即p.298d>h，可导致综合征缺牙表型。以上实施例均为已经报道的突变位点即在表1中已列出。若检测样本过程中翻译出的tnf结构域氨基酸序列发生错义突变，且该错义突变所在位点已在表1中列出，但突变的碱基不一致或突变的氨基酸不一致，则为未报道的新突变，但突变可导致的表型可以根据已发现的突变为依据进行预测。若检测样本过程中翻译出的tnf结构域氨基酸序列发生错义突变，且该错义突变未在表1中列出，即发现了新的、未报道的、新的eda基因tnf编码区的突变，则需要检索表2相对应的氨基酸位点，对eda蛋白tnf结构域未知突变的表型进行预测。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。表1.已报道的eda蛋白tnf结构域编码区错义突变及相应表型表2eda蛋白tnf结构域的侧链平均rsa值及其未知表型预测sequencelisting<110>华中科技大学<120>外异蛋白a基因tnf编码区突变检测的引物组、试剂盒及检测方法<130>11<160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1gaaatgtagtcagtaacatccc22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2agcaaagaatgacttcgtatgc22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3ttctctgctttcaaatgctctt22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4aaaacaaaacaaaagaagctgg22<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5cagctcatctgagaagattctg22<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6catcaactgtcctgttaactca22<210>7<211>52<212>dna<213>人体<400>7ccagctgtggtgcatctacagggccaagggtcagcaattcaagtcaagaatg52<210>8<211>60<212>dna<213>人体<400>8atctttcaggtggagtgctcaatgactggtctcgcatcactatgaaccccaaggtgttta60<210>9<211>252<212>dna<213>人体<400>9gtatactacatcaacttcactgactttgccagctatgaggtggtggtggatgagaagccc60ttcctgcagtgcacacgcagcatcgagacgggcaagaccaactacaacacttgctatacc120gcaggcgtctgcctcctcaaggcccggcagaagatcgccgtcaagatggtgcacgctgac180atctccatcaacatgagcaagcacaccacgttctttggggccatcaggctgggtgaagcc240cctgcatcctag252<210>10<211>429<212>dna<213>人体<400>10gtggtgcatctacagggccaagggtcagcaattcaagtcaagaatgatctttcaggtgga60gtgctcaatgactggtctcgcatcactatgaaccccaaggtgtttaagctacatccccgc120agcggggagctggaggtactggtggacggcacctacttcatctatagtcaggtagaagta180tactacatcaacttcactgactttgccagctatgaggtggtggtggatgagaagcccttc240ctgcagtgcacacgcagcatcgagacgggcaagaccaactacaacacttgctataccgca300ggcgtctgcctcctcaaggcccggcagaagatcgccgtcaagatggtgcacgctgacatc360tccatcaacatgagcaagcacaccacgttctttggggccatcaggctgggtgaagcccct420gcatcctag429<210>11<211>142<212>prt<213>人体<400>11valvalhisleuglnglyglnglyseralaileglnvallysasnasp151015leuserglyglyvalleuasnasptrpserargilethrmetasnpro202530lysvalphelysleuhisproargserglygluleugluvalleuval354045aspglythrtyrpheiletyrserglnvalgluvaltyrtyrileasn505560phethraspphealasertyrgluvalvalvalaspglulysprophe65707580leuglncysthrargserilegluthrglylysthrasntyrasnthr859095cystyrthralaglyvalcysleuleulysalaargglnlysileala100105110vallysmetvalhisalaaspileserileasnmetserlyshisthr115120125thrphepheglyalaileargleuglyglualaproalaser130135140当前第1页12