卡萨烷二萜衍生物及其含该衍生物的提取物的制备方法和应用与流程

本发明属于医药技术领域，涉及卡萨烷二萜衍生物及其含该衍生物的提取物的制备，还涉及该类衍生物及其提取物在制备抗炎药物中的应用。

背景技术

苦石莲(caesalpiniaminaxhance)又称为猫爪簕、南蛇簕、老鸦枕头等，为豆科云实属(caesalpinia)植物喙荚云实的成熟种子。苦石莲主要分布于广东、广西、云南、四川、贵州和海南等地，多生长于低海拔的次生林缘、灌木丛中以及狂野草丛中。其药用部位有根、茎、种子，其中尤以采用成熟的种子以仁入药居多。据古医药书籍记载苦石莲有活血散瘀、止痛、清热、除湿等功效，民间多用于治疗感冒发烧、痢疾、淋浊、尿血、跌打损伤等症。苦石莲味苦、性寒，归心、脾、肾经，为我国中药典籍《中华本草》等收录，并被广西中药材标准、贵州中药材标准、四川中药材标准等收载。经研究，从苦石莲同属(云实属)植物及其他药用植物、微生物中分离得到的卡萨烷类化合物(又作卡山烷)不仅具有很好的抗病毒活性(jiangrw,masc,butpph,maktcw.newantiviralcassanefuranoditerpenesfromcaesalpiniaminax.j.nat.prod,2001,64:1266–1272.)，而且还具有抗炎(ruijuandong,jiuzhiyuan,shilongwu,jianhuan,xiaotongxu,zhaohuawu,huiyuangao.anti-inflammationfuranoditerpenoidsfromcaesalpiniaminaxhance.phytochemistry，2015,117:325-332.)、止痛、抗癌(lidm,mal,liugm,hulh.cassanediterpene-lactonesfromtheseedofcaesalpiniaminaxhance.chembiodivers,2006,3:1260–1265.)等活性。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供含卡萨烷二萜衍生物的提取物的制备方法及该提取物在医药领域的应用，尤其是在制备抗炎、免疫调节、治疗类风湿药、肠炎药物中的应用。

本发明的其次目的在于提供了卡萨烷二萜衍生物，包括呋喃型卡萨烷、呋喃内酯型卡萨烷、开环型卡萨烷及重排型卡萨烷二萜衍生物的制备方法及其在制备抗炎、调节免疫、治疗类风湿和肠炎药物中的应用。其中所含的卡萨烷具有以下结构通式及意义。

1.呋喃型卡萨烷二萜，结构通式为：

呋喃型卡萨烷二萜类化合物的基本母核中：

r1，r2，r3，r4和r5可以独立地为h、oh、＝o；或由相应位置的-oh衍生的烷氧基[-o-(ch2)n-,n为1～6之间的整数]、胺基、＝ch2键、一元羧基(-cooh)及其与苯酚衍生物形成的酯、或与c1-c10烷基醇形成的酯包括内酯。

r6和r7独立地为c1-c6烷基、oh、h或-oh衍生的烷氧基[-o-(ch2)n-,n为1～6之间的整数]、胺基、＝o、＝ch2键、一元羧基(-cooh)及其与苯酚衍生物形成的酯、或与c1-c10烷基醇形成的酯包括内酯。

作为优选，r1，r2，r3，r4和r5可以独立地为h、oh、＝o、oac；

r6和r7独立地为甲基、oh、h、＝o、＝ch2键、甲酸甲酯、乙酯基。

2.呋喃内酯型卡萨烷二萜，结构通式为：

呋喃内酯型卡萨烷二萜类化合物的基本母核中：

r1，r2，r3和r4可以独立地为h、oh、＝o、或由相应位置的-oh衍生的烷氧基[-o-(ch2)n-,n为1～6之间的整数]、胺基、＝ch2键、一元羧基(-cooh)及其与苯酚衍生物形成的酯、或与c1-c10烷基醇形成的酯包括内酯。

r5可以为h、-oh、-cooh，以及-oh衍生的醚基[-o-(ch2)n-,n为1～6之间的整数，或环醚]，或-oh脱水产物。

r6和r7可以独立地为-ch3、-oh、h，或-oh衍生的烷氧基[-o-(ch2)n-,n为1～6之间的整数]、胺基、＝o、＝ch2键、一元羧基(-cooh)及其与苯酚衍生物形成的酯、或与c1-c10烷基醇形成的酯包括内酯。

3.a环开环的卡萨烷二萜，结构通式为：

a环开环的卡萨烷二萜通式(iii)中：

r1为h、oh、＝o、或由相应位置的-oh衍生的烷氧基[-o-(ch2)n-,n为1～6之间的整数]、胺基、＝ch2键、一元羧基(-cooh)及其与苯酚衍生物形成的酯、或与c1-c10烷基醇形成的酯包括内酯。

r2为-ch3、-oh、h，或-oh衍生的烷氧基[-o-(ch2)n-,n为1～6之间的整数]、胺基、＝o、＝ch2键、一元羧基(-cooh)及其与苯酚衍生物形成的酯、或与c1-c10烷基醇形成的酯类包括内酯。

通式(iv)中：

r1、r2为h、oh、＝o、或由相应位置的-oh衍生的烷氧基[-o-(ch2)n-,n为1～6之间的整数]、胺基、＝ch2键、一元羧基(-cooh)及其与苯酚衍生物形成的酯、或与c1-c10烷基醇形成的酯类包括内酯；

r3为-ch3、-oh、h，或-oh衍生的烷氧基[-o-(ch2)n-,n为1～6之间的整数]、胺基、＝o、＝ch2键、一元羧基(-cooh)及其与苯酚衍生物形成的酯、或与c1-c10烷基醇形成的酯类包括内酯。

本发明目的还在于提供了包含所述的卡萨烷二萜衍生物的提取物在制备用于治疗巨噬细胞介导的类风湿关节炎、肠炎以及其他免疫类疾病上的药物。单体成分对单核巨噬细胞分泌炎症因子il-1β、il-6、il-18、tnf-α有显著抑制作用，表现出免疫调节作用，巨噬细胞功能异常与类风湿关节炎、溃疡性结肠炎都存在高度相关性。

活性试验结果表明，本发明的卡萨烷二萜衍生物及包含该类衍生物的提取物可以用于制备抗炎、免疫调节、抗治疗类风湿和抗肠炎类药物。

本发明所提供的32种化合物的结构、名称如下。

化合物1-21分别为：caesalpininf1(1)；caesalpininm1(2)；caesalpininm2(3)；caesalpininm3(4)；caesalmine1(5)；caesalmine2(6)；caesalmine3(7)；caesaldekarink1(8)；norcaesalpininse(9)；7-acetoxybonducellpinc(10)；ζ-caesalpin(11)；caesaldekarinba(12)；caesalminc(13)；caesalmind(14)；caesalmine(15)；caesalpinins(16)；kcaesalpininm4(17)；caesalpininm5(18)；caesalpininf2(19)；caesalpininf3(20)；bonducellpinc(21).

化合物22-28分别为:neocaesalpinm(22)；neocaesalpinl(23)；methyl1α,7β-diacetoxy-5α,12α-dihydroxycass-13(15)-en-16,12-olide-17β-carboxylate(24)；methyl,7β-acetoxy-1α,5α,12α-trihydroxycass-13(15)-en-16,12-olide-17β-carboxylate(25)；12-ethyl-o-neocaesalpinm(26)；neocaesalpina；neocaesalpinl1.

化合物29-32结构和名称如下：

化合物1-32谱学数据如下：

化合物1caesalpininf1

白色粉末(甲醇)，hr-esi-msm/z:441.1888[m+na]⁺(calcdforc23h30o7na，441.1884),ir(kbr)vmax3437,1733,1372,1242,1052cm^-1.¹h-nmr(300mhz,cd3od)δh:1.00(3h,s,h-18),1.28(3h,s,h-19),1.48(3h,s,h-20),1.99(3h,s,oac),3.71(3h,s,h-17),5.01(1h,m,h-7),6.09(1h,d,j＝1.68hz,h-14),7.20(1h,d,j＝1.08hz,h-15).¹³c-nmr(150mhz,cd3od)δ:213.4(c-1),35.6(c-2),37.8(c-3),39.0(c-4),83.0(c-5),32.8(c-6),75.9(c-7),39.8(c-8),37.8(c-9),55.6(c-10),23.9(c-11),151.5(c-12),112.5(c-13)，46.2(c-14),108.4(c-15),141.3(c-16),175.1(c-17),27.3(c-18),25.9(c-19),16.5(c-20),52.1(cooch3).

化合物2caesalpininm1

白色粉末(甲醇)，hr-esi-msm/z:453.2120[m+h]⁺(calcdforc23h33o9,453.2125),ir(kbr)vmax3419,1707,1629,1384,1114cm^-1.¹h-nmr(600mhz,cdcl3)δh:1.04(3h，s,h-20),1.32(3h,s,h-19),1.41(3h,s,h-18),2.10(3h,s,oac),3.72(3h,s,h-17),4.01(1h,br.s,h-1),4.32(1h,m,h-2),4.46(1h,t,h-7),5.82(1h,dj＝9.12hz,h-6),6.40(1h,d,j＝1.26hz,h-14),7.48(1h,d,j＝1.54hz,h-15).¹³c-nmr(150mhz,cdcl3)δ:76.0(c-1),65.1(c-2),41.9(c-3),40.8(c-4),79.8(c-5),77.5(c-6),76.2(c-7),42.2(c-8),36.7(c-9),46.2(c-10),22.1(c-11),151.2(c-12),115.1(c-13),141.7(c-14),109.1(c-15),36.1(c-16),175.6(c-17),31.1(c-18),25.6(c-19),16.0(c-20),51.6(cooch3).

化合物3caesalpininm2

白色粉末(甲醇)，hr-esi-msm/z:443.2046[m+na]⁺(calcdforc23h33o7na，443.2221),ir(kbr)vmax3426,1726,1626,1383,1054cm^-1.¹h-nmr(300mhz,cdcl3)δh:0.99(3h，s,h-18),1.05(3h,s,h-19),1.11(3h,s,h-20),1.37(3h,s,h-19),1.99(3h,s,7-oac),3.72(3h,s,h-17),5.11(1h,m,h-7),6.11(1h,d,j＝1.86hz,h-14),7.23(1h,d,j＝1.71hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,cdcl3)δ:72.5(c-1),26.2(c-2),29.9(c-3),38.8(c-4),80.0(c-5),32.9(c-6),77.4(c-7),39.0(c-8),36.8(c-9),43.7(c-10),21.6(c-11),150.8(c-12),113.3(c-13),46.4(c-14),108.6(c-15),141.6(c-16),175.2(c-17),28.0(c-18),25.1(c-19),17.9(c-20),52.1(cooch3).

化合物4caesalpininm1

白色粉末(甲醇)，hr-esi-msm/z:475.1934[m+na]⁺(calcdforc23h32o9na，475.1939),ir(kbr)vmax3456,1734,1375,1237,1038cm^-1.¹h-nmr(300mhz,dmso)δh:1.13(3h，s,h-20),1.28(3h,s,h-19),1.26(3h,s,h-18),2.06(3h,s,oac),3.37(3h,s,h-17),4.06(1h,m,h-2),5.19(1h,m,h-7),6.40(1h,d,j＝1.26hz,h-14),7.24(1h,d,j＝1.69hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,dmso)δ:75.4(c-1),65.8(c-2),41.1(c-3),41.4(c-4),79.8(c-5)，74.7(c-6),81.8(c-7),37.8(c-8),36.1(c-9),45.5(c-10),21.7(c-11),150.4(c-12),113.3(c-13),46.1(c-14),108.5(c-15),141.8(c-16),174.7(c-17),31.3(c-18),25.6(c-19),16.5(c-20),52.3(cooch3).

化合物5caesalmine1

白色针状结晶(氯仿-甲醇)，hr-esi-msm/z:473.2144[m+na]⁺(calcdforc24h34o8na，475.2146),ir(kbr)vmax3435,1742,1373,12356,1038cm^-1.¹h-nmr(300mhz,cdcl3)δh:1.19(3h,s,h-20),1.26(3h,s,h-19),1.28(3h,s,h-18),2.10(3h,s,1-oac),2.12(3h,s,7-oac),3.95(1h,m,h-6),4.85(1h,m,h-1),5.57(1h,m,h-7),6.38(1h,d,j＝1.83hz,h-14),7.25(1h,d,j＝1.53hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,cdcl3)δ:76.1(c-1),22.5(c-2),32.3(c-3),39.1(c-4),79.4(c-5),75.5(c-6),76.4(c-7),47.5(c-8),35.8(c-9),44.5(c-10),22.4(c-11),147.7(c-12),125.1(c-13),72.6(c-14),107.6(c-15),142.1(c-16),25.7(c-17),31.3(c-18),25.3(c-19),17.3(c-20).

化合物6caesalmine2

白色针状结晶(氯仿-甲醇)，hr-esi-msm/z:485.1933[m+na]⁺(calcdforc24h34o8na，4851.1948),ir(kbr)vmax3585,1740,1454,1371,1235cm^-1.¹h-nmr(600mhz,cdcl3)δh:1.09(3h,s,h-18),1.10(3h,s,h-19),1.14(3h,s,h-20),1.37(3h,s,h-17),2.05(3h,s,1-oac),2.14(3h,s,6-oac),4.36(1h,m,h-7),4.78(1h,m,h-1),5.36(1h,d,j＝9.30hz,h-6),6.37(1h,d,j＝1.62hz,h-14),7.21(1h,d,j＝0.78hz,h-15).¹³c-nmr(150mhz,cdcl3)δ:75.7(c-1),22.0(c-2),32.2(c-3),38.6(c-4),79.9(c-5),76.2(c-6),71.8(c-7),48.2(c-8),35.1(c-9),45.2(c-10),22.0(c-11),147.5(c-12),124.2(c-13),72.7(c-14),107.5(c-15),142.0(c-16),26.1(c-17),30.6(c-18),24.8(c-19),17.2(c-20).

化合物7caesalmine3

白色针状结晶(氯仿-甲醇)，hr-esi-msm/z:415.20918[m+na]⁺(calcdforc22h32o6na，415.2093),ir(kbr)vmax3585,1740,1457,1371,1235cm^-1.¹h-nmr(300mhz,cdcl3)δh:1.06(3h,s,h-18),1.11(3h,s,h-19),1.15(3h,s,h-20),1.49(3h,s,h-17),2.08(3h,s,1-oac),4.48(1h,m,h-7),4.78(1h,m,h-1),6.42(1h,d,j＝1.89hz,h-14),7.25(1h,d,j＝1.65hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,cdcl3)δ:75.9(c-1),22.7(c-2),35.1(c-3),38.6(c-4),78.5(c-5),30.1(c-6),68.9(c-7),49.5(c-8),35.7(c-9),43.8(c-10),22.1(c-11),148.3(c-12),124.6(c-13),73.6(c-14),107.3(c-15),142.0(c-16),26.0(c-17),28.3(c-18),25.4(c-19),18.0(c-20).

化合物8caesaldekarink1

白色粉末(氯仿-甲醇)，hr-esi-msm/z:543.2575[m+na]⁺(calcdforc283h40o9na，543.2576),ir(kbr)vmax3445,1746,1373,1245,1033cm^-1.¹h-nmr(300mhz,cdcl3)δh:1.12(3h,s,h-18),1.14(3h,s,h-19),1.26(3h,s,h-20),1.97(3h,s,7-oac),2.05(3h,s,6-oac),2.07(3h,s,5-oac),4.85(1h,s,h-1),5.43(1h,m,h-6),5.76(1h,m,h-7),6.21(1h,d,j＝1.32hz,h-14),7.21(1h,d,j＝1.52hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,cdcl3)δ:75.8(c-1),22.4(c-2),32.3(c-3),38.6(c-4),79.2(c-5),75.5(c-6),72.9(c-7),39.9(c-8),35.8(c-9),44.8(c-10),22.7(c-11),149.6(c-12),122.8(c-13),77.8(c-14),107.9(c-15),141.9(c-16),25.6(c-17),30.7(c-18),25.1(c-19),17.4(c-20).

化合物9norcaesalpininse

白色粉末(甲醇)，¹h-nmr(300mhz,cdcl3)δh:1.06(3h,s,h-18),1.10(3h,s,h-19),1.23(3h,s,h-20),2.09(3h,s,1-oac),4.38(1h,m,h-7),4.93(1h,m,h-1),6.65(1h,d,j＝1.80hz,h-14),7.32(1h,d,j＝1.68hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,cdcl3)δ:75.4(c-1),21.7(c-2),30.1(c-3),38.6(c-4),78.1(c-5),33.8(c-6),67.4(c-7),51.2(c-8),38.8(c-9),43.8(c-10),22.1(c-11),166.8(c-12),120.1(c-13),198.6(c-14),106.5(c-15),143.6(c-16),28.1(c-17),25.1(c-18),18.3(c-19).

化合物107-acetoxybonducellpinc

白色粉末(甲醇)，¹h-nmr(300mhz,d6-dmso)δh:1.04(3h,s,h-18),1.07(3h,s,h-19),1.21(3h,s,h-20),1.98(3h,s,1-oac),2.08(3h,s,7-oac),3.72(3h,s,cooch3),4.91(1h,m,h-1),5.21(1h,td,h-7),6.11(1h,d,j＝1.74hz,h-14),7.23(1h,d,j＝1.47hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,d6-dmso)δ:75.6(c-1),22.7(c-2),30.2(c-3),38.7(c-4),78.5(c-5),36.9(c-6),76.3(c-7),43.8(c-8),32.3(c-9),39.2(c-10),21.6(c-11),150.1(c-12),113.6(c-13),46.2(c-14),108.6(c-15),141.7(c-16),174.9(c-17),28.2(c-18),25.1(c-19),17.9(c-20),52.1(3h,s,cooch3).

化合物11ζ-caesalpin

白色粉末(甲醇)，¹h-nmr(600mhz,cdcl3)δh:1.22(3h,s,h-20),1.28(3h,s,h-18),1.29(3h,s,h-19),2.08(3h,s,1-oac),2.10(3h,s,7-oac),4.87(2h,m,h-1,h-17),5.07(1h,d,j＝1.56hz,h-17),5.53(1h,t,h-7),6.41(1h,d,j＝1.80hz,h-14),7.23(1h,d,j＝1.38hz,h-15).¹³c-nmr(150mhz,cdcl3)δ:75.9(c-1),23.2(c-2),32.3(c-3),38.9(c-4),79.3(c-5),76.0(c-6),77.4(c-7),41.6(c-8),38.1(c-9),44.2(c-10),22.3(c-11),150.8(c-12),119.9(c-13),139.0(c-14),106.7(c-15),142.1(c-16),105.6(c-17),31.3(c-18),25.3(c-19),17.3(c-20).

化合物12caesaldekarinba

白色针状结晶(氯仿-甲醇)，¹h-nmr(300mhz,d6-dmso)δh:1.05(3h,s,h-17),1.20(3h,s,h-20),1.36(3h,s,h-18),1.37(3h,s,h-19),1.98(3h,s,1-oac),2.14(3h,s,2-oac),4.08(1h,m,h-6),5.20(1h,m,h-1),5.26(1h,m,h-2),6.18(1h,d,j＝1.74hz,h-14),7.22(1h,d,j＝1.44hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,d6-dmso)δ:75.3(c-1),67.5(c-2),37.8(c-3),41.4(c-4),78.4(c-5),71.0(c-6),35.3(c-7),33.9(c-8),32.1(c-9),46.5(c-10),22.4(c-11),148.7(c-12),122.7(c-13),31.1(c-14),109.7(c-15),141.1(c-16),17.4(c-17),31.6(c-18),26.1(c-19),16.6(c-20).

化合物13caesalminc

白色粉末(甲醇),¹h-nmr(300mhz,cdcl3)δh:1.15(6h,s,h-18,19),1.30(3h,s,h-20),1.96(3h,s,1-oac),2.07(3h,s,7-oac),4.88(1h,m,h-1),4.94(1h，br.s,h-17),5.08(1h,br.s,h-17),5.58(1h,br.s,h-6),6.40(1h,d,j＝1.89hz,h-14),7.23(1h,d,j＝1.77hzh-15).¹³c-nmr(75mhz,cdcl3)δ:75.2(c-1),22.2(c-2),32.5(c-3),38.7(c-4),79.5(c-5),75.5(c-6),75.8(c-7),45.8(c-8),38.2(c-9),44.7(c-10),23.4(c-11),150.0(c-12),120.0(c-13),138.6(c-14),106.7(c-15),142.2(c-16),105.8(c-17),30.9(c-18),25.2(c-19),17.3(c-20).

化合物14caesalmind

白色粉末(甲醇)，¹h-nmr(300mhz,cdcl3),δh:1.12(3h,s,h-18),1.15(3h,s,h-19),1.27(3h,s,h-20),1.43(3h,s,h-17),2.01(3h,s,6-oac),2.08(6h,s,1-oac,7-oac),4.88(1h,m,h-1),5.67(1h,m,h-6),6.39(1h,d,j＝1.89hz,h-14),7.23(1h,d,j＝1.74hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz，cdcl3)δ:68.9(c-1),23.0(c-2),32.5(c-3),38.7(c-4),79.0(c-5),76.0(c-6),77.1(c-7),44.5(c-8),34.0(c-9),47.3(c-10),23.0(c-11),149.8(c-12),123.2(c-13),77.4(c-14),108.0(c-15),141.8(c-16),30.7(c-17),29.0(c-18),25.1(c-19),17.5(c-20).

化合物15caesalmine

白色粉末(甲醇),¹h-nmr(300mhz,cdcl3)δh:1.09(3h,s,h-18),1.10(3h,s,h-19),1.21(3h,s,h-20),1.44(3h,s,h-17),1.90(3h,s,6-oac),2.01(6h,s,1-oac,7-oac),4.80(1h,m,h-1),5.46(1h,m,h-6),5.60(1h,m,h-7),6.31(1h,d,j＝1.89hz,h-14),7.17(1h,d,j＝1.71hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,cdcl3),δ:68.9(c-1),21.6(c-2),32.2(c-3),38.5(c-4),79.1(c-5),75.0(c-6),75.7(c-7),44.6(c-8),35.8(c-9),47.6(c-10),22.6(c-11),147.5(c-12),125.5(c-13),73.7(c-14),107.5(c-15),141.8(c-16),30.6(c-17),24.9(c-18),24.8(c-19),17.2(c-20).

化合物16caesalpininsk

白色粉末(甲醇),¹h-nmr(300mhz,cdod)δh:1.06(3h,s,h-20),1.11(3h,s,h-18),1.13(3h,s,h-17),1.13(3h,s,h-19),2.09(3h,s,1-oac),4.19(1h,m,h-7),4.90(1h,m,h-1),6.21(1h,d,j＝1.86hz,h-14),7.23(1h,d,j＝1.77hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,cdod)δ:75.8(c-1),22.5(c-2),30.0(c-3),38.4(c-4),78.7(c-5),35.3(c-6),67.7(c-7),42.5(c-8),31.9(c-9),43.4(c-10),22.0(c-11),148.4(c-12),122.2(c-13),27.3(c-14),109.8(c-15),140.7(c-16),17.1(c-17),28.1(c-18),25.2(c-19),17.7(c-20).

化合物17caesalpininm4

白色粉末(甲醇),hresi-msm/z459.1986[m+na]⁺(calc.m/zforc23h32nao8，459.1989)；(c0.18,meoh)；uv(meoh)λmax(logε)215(3.70)nm；cd(meoh)nm(δε)223(-8.9)；ir(kbr)νmax3436,2947,1737,1645,1382,1245,1161,1029cm^-1.¹h-nmr(600mhz,cdcl3)δh:1.09(3h,s,h-18),1.13(3h,s,h-19),1.19(3h,s,h-20),2.14(3h,s,6-oac),3.73(3h,s,och3),3.82(1h,br.t,h-1),3.82(1h,t,j＝9.4hz,h-7),5.34(1h,d,j＝9.4hz,h-6),6.17(1h,s,h-14),7.25(1h,s,h-15).¹³c-nmr(150mhz,cdcl3)δ:72.5(c-1),25.7(c-2),32.0(c-3),38.7(c-4),80.7(c-5),76.6(c-6),77.3(c-7),41.4(c-8),35.8(c-9),45.0,(c-10),21.6(c-11),150.5(c-12),113.4(c-13),46.3,(c-14),108.5(c-15),141.4(c-16),175.7(c-17),30.5(c-18),25.3(c-19),17.0(c-20),52.3(och3).

化合物18caesalpininm5

白色粉末(甲醇),hresi-msm/z517.2057[m+na]⁺(calc.m/zforc25h34nao10,517.2044)；(c0.06,meoh),uv(meoh)λmax(logε)214(3.67)nm；ir(kbr)νmax3443,2950,1736,1650,1371,1247,1164,1033cm^-1；cd(meoh)nm(δε)223(-10.0).¹h-nmr(600mhz,cdcl3)δh:1.17(3h,s,h-18),1.22(3h,s,h-19),1.26(3h,s,h-20),2.15(3h,s,2-oac),2.11(3h,s,6-oac),3.73(3h,s,och3),3.83(1h,br.t,h-1),5.26(1h,ddd,j＝13.0,4.7,2.6hz,h-2),3.89(1h,t,j＝9.4hz,h-7),5.31(1h,d,j＝9.4hz,h-6),6.18(1h,s,h-15),7.25(1h,s,h-16).¹³c-nmr(150mhz，cdcl3)δ:76.2(c-1),69.3(c-2),36.7(c-3),41.0(c-4),79.6(c-5),76.2(c-6),76.2(c-7),40.7(c-8),35.7(c-9),46.3(c-10),21.7(c-11),150.0(c-12),113.5(c-13),46.3(c-14),108.6(c-15),141.6(c-16),175.5(c-17),30.5(c-18),25.3(c-19),16.5(c-20),52.4(och3).

化合物19caesalpininf2

白色粉末(甲醇),hresi-msm/z435.2010[m+h]⁺(calc.m/zforc23h31o8,435.2013)；(c0.13,meoh)；uv(meoh)λmax(logε)215(3.71)nm；cd(meoh)nm(δε)225(-27.2)；ir(kbr)νmax3479,2921,1719,1381,1238cm^-1.¹h-nmr(600mhz,cdcl3)δh:1.16(3h,s,h-19),1.22(3h,s,h-18),1.393h,s,h-20),2.15(3h,s,2-oac),3.68(3h,s,och3),5.80(1h,dd,j＝14.1,5.8hz,h-2),3.82(1h,td,j＝10.7,4.7hz,h-7),6.10(1h,s,h-15),7.25(1h,s,h-16).¹³c-nmr(150mhz,cdcl3)δ:209.7(c-1),72.2(c-2),39.2(c-3),37.9(c-4),78.8(c-5),37.6(c-6),72.5(c-7),43.1(c-8),39.1(c-9),54.3(c-10),24.5(c-11),151.4(c-12),112.1(c-13),46.7(c-14),108.2(c-15),141.2(c-16),176.6(c-17),26.5(c-18),28.2(c-19),16.9(c-20),52.3(och3).

化合物20caesalpininf3

白色针状结晶(氯仿-甲醇),hresi-msm/z477.2098[m+h]⁺(calc.m/zforc25h33o9,477.2119)；(c0.03,meoh)；uv(meoh)λmax(logε)214(3.73)nm；cd(meoh)nm(δε)223(-13.2)；ir(kbr)νmax3431,2923,1730,1642,1384,1239,1131,1054cm^-1.1h-nmr(600mhz,cdcl3)δh:1.16(3h,s,h-19),1.21(3h,s,h-18),1.45(3h,s,h-20),2.10(3h,s,2-oac),4.97(3h,td,j＝11.5,4.8hz,7-oac),6.38(1h,s,h-14),7.25(1h,s,h-15).¹³c-nmr(150mhz,cdcl3)δ:209.3(c-1),72.3(c-2),39.3(c-3),38.1(c-4),78.9(c-5),33.9(c-6),75.9(c-7),39.7(c-8),39.3(c-9),54.6(c-10),24.6(c-11),151.6(c-12),112.0(c-13),46.2(c-14),108.2(c-15),141.5(c-16),175.0(c-17),26.7(c-18),28.3(c-19),17.2(c-20),52.2(och3).

化合物21bonducellpinc

白色粉末(甲醇),(c0.78,chcl3),¹h-nmr(300mhz,cdcl3)δh:1.05(3h,s,h-18),1.09(3h,s,h-19),1.19(3h,s,h-20),2.10(3h,s,1-oac),4.00(1h,m,h-7),4.90(1h,m,h-1),6.42(1h,d,j＝2.5hz,h-14),7.25(1h,d,j＝2.5hz,h-15).¹³c-nmr(75mhz,cdcl3)δ:75.5(c-1),22.5(c-2),30.0(c-3),38.4(c-4),78.5(c-5),36.2(c-6),73.4(c-7),42.4(c-8),36.5(c-9),43.6(c-10),21.5(c-11),150.0(c-12),113.6(c-13),46.4(c-14),108.5(c-15),141.4(c-16),176.0(c-17),28.0(c-18),25.0(c-19),17.7(c-20).

化合物22neocaesalpinm

白色粉末(氯仿-甲醇),¹h-nmr(300mhz,cdcl3)δh:1.11(6h,s,h-18,19),1.14(3h,s,h-20),1.56(3h,s,h-17),1.99(3h,s,6-oac),2.07(3h,s,1-oac),2.12(3h,s,7-oac),3.15(3h,s,och3),4.86(1h,m,h-7),5.45(1h,m,h-6),5.64(1h,m,h-1),6.08(1h,s,h-14).¹³c-nmr(75mhz,cdcl3)δ:72.8(c-1),22.5(c-2),32.4(c-3),38.7(c-4),79.3(c-5),74.9(c-6),75.2(c-7),51.1(c-8),33.7(c-9),44.6(c-10),37.4(c-11),106.6(c-12),172.3(c-13),75.3(c-14),116.9(c-15),170.4(c-16),20.2(c-17),30.6(c-18),24.6(c-19),16.9(c-20),51.1(och3).

化合物23neocaesalpinl

白色粉末(氯仿-甲醇),(c0.2,meoh),¹h-nmr(cdcl3,300mhz)谱中,δh:5.93(1h,s,h-16),5.67(1h,t,j＝9hz,h-7,5.46(1h,d,j＝9hz,h-6,4.80(1h,br.sh-1),2.16(3h,s,7-oac),2.08(3h,s,6-oac),2.00(3h,s,1-oac),1.64(3h,s,h-17),1.13(3h,s,h-18),1.13(h-19),1.17(h-20).¹³c-nmr(cdcl3,75mhz)谱中,δ:17.0(c-20),21.8(7-oac),21.6(6-oac),21.4(1-oac),21.0(c-17),22.4(c-2),24.8(c-19),30.7(c-18),32.4(c-3),34.1(c-9),37.8(c-11),38.7(c-4),44.1(c-10),51.1(c-8),72.7(c-1),75.0(c-14),75.1(c-7),75.6(c-6),79.4(c-5),104.8(c-12),114.0(c-15),171.0(c-16),175.0(c-13),169.8(1-oac),169.9(7-oac),170.6(6-oac).

化合物24methyl1α,7β-diacetoxy-5α,12α-dihydroxycass-13(15)-en-16,12-olide-17β-carboxylate无色针状结晶(氯仿-甲醇)，(c0.23,chcl3)。hresimsm/z[m+h]⁺495.2222。¹h-nmr(600mhz,cdcl3)及¹³c-nmr(150mhz,cdcl3):74.8(c-1)，22.6(c-2),29.9(c-3),38.3(c-4),78.2(c-5),32.1(c-6),74.7(c-7),44.0(c-8),36.0(c-9),43.4(c-10),36.1(c-11),104.1(c-12),164.8(c-13),48.4(c-14),115.4(c-15),169.3(c-16),171.1(c-17),27.9(c-18),24.5(c-19),17.5(c-20).169.7/21.3(c1-ococh3),169.9/21.2(c7-ococh3),52.2(-och3)

化合物25methyl,7β-acetoxy-1α,5α,12α-trihydroxycass-13(15)-en-16,12-olide-17β-carboxylate无色针状结晶(氯仿-甲醇)，(c0.11,chcl3)。hresimsm/z[m+na]⁺475.1941。¹³c-nmr(150mhz,cdcl3)谱数据:72.1(c-1),25.6(c-2),29.7(c-3),38.5(c-4),80.1(c-5),32.9(c-6),75.1(c-7),43.7(c-8),35.9(c-9),43.4(c-10),36.1(c-11),104.1(c-12),164.2(c-13),48.2(c-14),115.4(c-15),169.3(c-16),171.2(c-17),27.7(c-18),24.6(c-19),17.5(c-20),170.3/21.2(c7-ococh3),52.2(-och3).

化合物2612-ethyl-o-neocaesalpinm

无色针状结晶(氯仿-甲醇)，(c0.09,chcl3)。¹¹³c-nmr(150mhz,cdcl3)谱数据:75.1(c-1),22.3(c-2),32.2(c-3),38.4(c-4),79.1(c-5),74.7(c-6),72.6(c-7),50.8(c-8),33.5(c-9),44.4(c-10),37.6(c-11),106.3(c-12),172.5(c-13),74.9(c-14),116.4(c-15),168.6(c-16),20.0(c-17),30.4(c-18),24.4(c-19),16.6(c-20),168.8,21.1(c6-ococh3),170.7/21.3(c7-ococh3),58.8/14.8(c12-och2ch3).

化合物27neocaesalpina

白色粉末(氯仿-甲醇)，(c0.22,meoh)。¹h-nmr(cd3od,600mhz)：δ1.10(3h,s,ch3-18)，1.14(3h,s,ch3-20)，1.18(3h,s,ch3-19)，1.41(3h,s,ch3-17)，1.95(3h,s,2-ococh3)，2.19(3h,s,1-ococh3)，5.21(1h,br.s,h-1)，5.31(1h,m,h-2)，5.82(1h,s,h-15)。¹³c-nmr(cd3od,75mhz)谱数据:74.2(c-1),67.9(c-2),35.7(c-3),40.1(c-4),76.6(c-5),25.6(c-6),19.3(c-7),48.0(c-8),34.8(c-9),45.2(c-10),37.8(c-11),106.2(c-12),177.6(c-13),74.3(c-14),112.1(c-15),171.3(c-16),19.7(c-17),27.6(c-18),24.9(c-19),16.6(c-20),171.0/20.0(c1-ococh3),171.2/19.9(c2-ococh3).

化合物28neocaesalpinl1

白色针状结晶(氯仿-甲醇)，m.p.266-268℃，hr-ei-msm/z：538.2456[m]⁺；ir(kbr,cm^-1)：3447cm^-1(-oh)，1747cm^-1(c＝o)。¹³c-nmr(cdcl3,75mhz)谱中,δ:16.8(c-20),21.5(7-oac),21.67(6-oac),21.3(1-oac),20.6(c-17),22.6(c-2),24.6(c-19),30.6(c-18),32.4(c-3),33.9(c-9),37.4(c-11),38.6(c-4),44.8(c-10),50.5(c-8),71.7(c-1),74.6(c-14),71.7(c-7),75.5(c-6),78.6(c-5),107.3(c-12),116.9(c-15),170.7(c-16),176.0(c-13),170.0(1-oac),170.8(6-oac),171.3(7-oac)，51.2(12-och3)

化合物29spirocaesalmind

白色针晶(meoh)；(c0.20,meoh),uv(meoh)λmax(logε)217(3.71)nm；ir(kbr)vmax3441,2973,1746,1627,1373,1068cm^-1；hresi-msm/z：419.1656[m+h]⁺；¹³c-nmr(cdcl3,100mhz)信号数据,δ:201.3(c-1),98.4(c-2),51.1(c-3),45.5(c-4),95.6(c-5),74.1(c-6),82.1(c-7),44.4(c-8),32.8(c-9),56.7(c-10),21,7(c-11),151.6(c-12),113.1(c-13),41.6(c-14),107.5(c-15),142.1(c-16),172.3(c-17),29.6(c-18),24.8(c-19),9.8(c-20),169.1/21.9(-ococh3).

化合物30spirocaesalminb

白色针晶(meoh)；(c0.12,meoh)；uv(meoh)λmax(logε)214(3.69)nm；ir(kbr)vmax3445,2971,1746,1629,1373,1245,1065cm^-1；hresi-msm/z473.1781[m+na]⁺；¹³cnmr(cdcl3,150mhz)信号数据：δ：203.6(c-1),92.8(c-2),51.7(c-3),47.1(c-4),96.7(c-5),72.8(c-6),78.3(c-7),38.5(c-8),35.4(c-9),55.6(c-10),22.1(c-11),149.6(c-12),112.6(c-13),45.7(c-14),108.0(c-15),141.9(c-16),174.0(c-17),24.3(c-18),30.3(c-19),9.6(c-20),172.2/21.0(-ococh3),52.2(-och3)

化合物31spirocaesalminc

白色针晶(meoh)；(c0.12,meoh)；uv(meoh)λmax(logε)214(3.69)nm；ir(kbr)vmax3445,2971,1746,1629,1373,1245,1065cm^-1；hresi-msm/z487.1791[m+na]⁺；¹³cnmr(cdcl3,150mhz)：δ203.6(c-1),92.8(c-2),51.7(c-3),47.1(c-4),96.7(c-5),72.8(c-6),78.3(c-7),38.5(c-8),35.4(c-9),55.6(c-10),22.1(c-11),149.6(c-12),112.6(c-13),45.7(c-14),108.0(c-15),141.9(c-16),174.0(c-17),24.3(c-18),30.3(c-19),9.6(c-20),172.2/21.0(-ococh3),59.1/14.9(-och2ch3).

化合物32无色针晶(meoh)；(c0.28,chcl3)；uv(meoh)λmax(logε)215(3.68)nm；ir(kbr)νmax3451,2957,2852,1742,1280,1167cm^-1；hresi-msm/z433.1859[m+h]⁺，¹³c-nmr(cdcl3,150mhz)谱中,δ:203.3(c-1),102.3(c-2),52.5(c-3),42.1(c-4),91.9(c-5),77.8(c-6),80.5(c-7),36.7(c-8),35.4(c-9),53.4(c-10),21.9(c-11),149.0(c-12),112.8(c-13),44.0(c-14),108.5(c-15),142.0(c-16),174.1(c-17),26.5(c-18),29.0(c-19),11.0(c-20),170.6/21.9(-ococh3),52.4(-och3).

本发明所述的卡萨烷二萜衍生物及包含该类衍生物的提取物可以从苦石莲或同属中即云实属植物的种子、根、茎、叶、心材等各部位中分离得到。存在于药材粗粉水或醇提取液中的石油醚层、乙酸乙酯层、二氯甲烷层、氯仿层及正丁醇层，或存在于药材粗粉水或醇提取液中的经大孔吸附树脂、小孔吸附树脂、硅胶、氧化铝、ods处理的流份中，具有结构通式的化合物及其修饰得到的衍生物，具有很好的抗炎、抗类风湿关节炎、调节免疫活性，可以和药学上可接受的载体结合制备临床上可接受的药物，用于治疗炎症、类风湿性疾病、免疫紊乱。

本发明中提供的卡萨烷提取物、卡萨烷二萜衍生物的制备方法，可以从如下三种方法中任一种、或两种方法制备，得到卡萨烷类粗提物，其含量采用本组建立的紫外可见分光光度法，以5％香草醛/冰乙酸-高氯酸为显色剂，折合生药含量为0.2％-1.0％。具体方法如下：

方法一：

(1)取选定的药材粗粉(苦石莲或云实属等药用植物饮片或植物本身)，利用超声或溶剂加热提取法，采用3～15倍量水煎煮或30％～100％乙醇或甲醇回流提取，减压回收水或醇溶剂，残渣挥至无醇味或醇度低于10％后，以水溶解后离心取上清液。

(2)上清液用大孔树脂处理，用水-醇溶液洗脱，梯度为10％、30％、50％、70％、90％，富集50％～90％醇洗脱部分，得到卡萨烷类粗提物，折合生药计算含量为0.28％。

(3)上述粗提取物经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇等组成的不同溶剂系统进行洗脱，结合中低压制备分离色谱、高效液相色谱进行制备分离，以乙腈/水系统、甲醇/水系统进行分离，获得卡萨烷类单体化合物。

方法二：

(1)取选定的药材粗粉(苦石莲或云实属等药用植物饮片或植物本身)，利用超声或溶剂加热提取法，采用3～15倍量水煎煮或30％～100％乙醇或甲醇回流提取，减压回收水或醇溶剂，残渣挥至无醇味或醇度低于10％后，以水溶解，得混悬液。

(2)混悬液依此用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取次数1-5次，萃取体积(1:1-1:8)获得各萃取部位，分别回收溶剂得浸膏，其中氯仿层或二氯甲烷层浸膏为卡萨烷小极性组分；乙酸乙酯层为卡萨烷大极性组分。

(3)粗卡萨烷组分都可经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇等组成的不同溶剂系统进行洗脱，结合中低压制备分离色谱、高效液相色谱进行制备分离，以乙腈/水系统、甲醇/水系统进行分离，获得卡萨烷类化合物。

将富含卡萨烷的组分进行合并，其含量采用本组建立的紫外可见分光光度法，以5％香草醛/冰乙酸-高氯酸为显色剂，所得卡萨烷二萜折合生药含量为0.47％。

方法三：

(1)取选定的药材粗粉(苦石莲或云实属等药用植物饮片或植物本身)，利用超声或溶剂加热回流提取法，采用1～20倍量氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮回流提取，减压回收溶剂得浸膏，为卡萨烷粗提物。

(2)粗提物再经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇等组成的不同溶剂系统进行梯度洗脱，结合中低压制备分离色谱、高效液相色谱进行制备分离，以乙腈/水系统、甲醇/水系统进行分离，获得卡萨烷类化合物。

本发明提供的卡萨烷类化合物的制备方法(一)方法(二)中提到的醇为甲醇或乙醇，浓度为10％-100％，优选为：70％的乙醇。

本发明提供的卡萨烷类化合物的制备方法(一)中，所提到的大孔树脂包括极性、非极性大孔树脂d-101、dm-301、hpd-100、ab-8等。

本发明提供的粗卡萨烷类化合物经硅胶柱色谱制备单体成分方法，所提到的有机溶剂为石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一种、二种或多种混合溶剂，溶剂组成比例均为(100:0-1:1)。

本发明提供的粗卡萨烷类化合物经中低压、高效液相色谱制备单体成分的方法，流动相为甲醇/水、或乙腈/水、或乙醇/水，混合比例为1:10-90:10，或甲醇/乙腈/水，混合比例为1:1:10-40:40:20。

附图说明

图1为卡萨烷二萜衍生物对免疫作用的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1苦石莲活性卡萨烷提取物的制备

取干燥苦石莲种子20kg,去皮得种仁11kg，用75％乙醇回流提取3次，料液比1:8，每次2h，减压回收溶剂，浓缩至20l。分别用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，得氯仿萃取物400g，乙酸乙酯萃取物115g，正丁醇萃取物150g。

其中氯仿层富含卡萨烷类化合物，经含量测定，其卡萨烷含量达到76.1％。

实施例2从苦石莲卡萨烷粗提物中分离卡萨烷类化合物

取实施例1中所得的氯仿层、乙酸乙酯层浸膏100g，采用硅胶开放柱色谱进行分离，流动相选用石油醚：乙酸乙酯(100:1-2:1)及二氯甲烷：甲醇(100：5-2:1)梯度洗脱，所得流份经过硅胶薄层色谱分析，合并相同流份后得10份洗脱物。

对石油醚：乙酸乙酯＝100:20流分11.0g进行分离，采用硅胶柱色谱法，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，在100:40处，对黄色固体进行sephadexlh-20分离，随后采用hplc分离，重结晶得化合物1-18、27。

对石油醚：乙酸乙酯＝100:40流分8.9g进行分离，采用硅胶柱色谱法，二氯甲烷：甲醇梯度洗脱，在100:10处，对固体部分采用hplc分离，得化合物19-22。

对石油醚：乙酸乙酯＝100:20流分9.1g进行分离，采用硅胶柱色谱法，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，在100:50处，对固体进行sephadexlh-20分离，随后采用hplc分离，得化合物23-26。

对二氯甲烷：甲醇＝100:5流分17.5g进行分离，采用ods开放柱色谱，甲醇：水(1:9-9:1)梯度洗脱，在9:1处，对固体采用hplc分离，得化合物28-32。

实施例3通过完全佐剂导致的大鼠类风湿关节炎检测卡萨烷粗提物对类风湿的防治和抗炎作用。

(1)制备佐剂性关节炎大鼠(adjuvantarthritis,aa)模型

正常健康清洁级雄性wistar大鼠(180-220g)于左后足趾关节处皮下注射freund’s完全佐剂0.1ml，造模当天大鼠左足肿胀明显,15天后踝关节以及软组织肿胀明显，体重增加缓慢甚至个别大鼠负增长，耳部红斑及结节，尾部结节，甚至破溃，出现继发性肿胀，提示造模成功，并从造模之日起开始按计量给药，阳性药0.05mg/kg,取实施例1中的苦石莲氯仿层卡萨烷粗提物，低剂量组400mg/kg,高剂量组800mg/kg,连续给药21天后取血。

(2)评价指标检测

a.用卡尺测量各组大鼠左右后足踝关节下0.5mm处的周长值。致炎当天为第0天，自注射后第7d起，隔天测量大鼠左后足趾周长，共测9次。

b.采用关节评分法(0～4级)得出关节炎指数。以关节红肿程度和范围，及关节肿大、变形情况为依据。aa大鼠致炎后第0天到第21天，观察并记录各组大鼠多发性关节炎病变的发生和严重程度，每3d进行一次，实验采用最大积分总和为8分的评分标准，即两只后足积分之和，来评价大鼠的发病情况。

以足趾周长测定大鼠致炎侧足趾踝至足趾处周长的变化(△cm)。结果如下表所示。高剂量对佐剂性大鼠类风湿关节炎肿胀度有显著性差异(p<0.05,p<0.01)。

aa模型大鼠足部周长增加值(n＝8)

注：与正常组比较，^▲p<0.001,与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01

aa模型大鼠足部周长增加值(n＝8)

大鼠关节炎指数评估

大鼠致炎后关节至组织处持续性红肿，并在7到15天达到峰值并伴随着溃烂出现鼓包，继而缓慢消肿。与模型组相比阳性药组及高、低两个剂量组出现显著地降低趋势。因而从表观上具有很好的治疗效果。

大鼠关节炎指数评分(n＝8)

实施例4：卡萨烷粗提物体(实施例1中的苦石莲氯仿层卡萨烷粗提物)对aa大鼠血清中的炎症因子表达的抑制活性

通过用酶联免疫分析法(elisa)检测佐剂性关节炎大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-1β(il-1β)、白介素-6(il-6)的表达量。

(1)样品制备

制备佐剂性关节炎大鼠模型，并从造模之日起开始按计量给药，阳性药组0.05mg/kg，低剂量萃取物400mg/kg,高剂量组800mg/kg,连续给药21天后取血。3000rpm离心，取上清液血清。

(2)elisa实验

实验操作参照试剂盒进行。

a.建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔各加入样品稀释液100μl,第一孔加标准品100μl,混匀后用加样器吸出100μl,移至第二孔，如此反复作倍比稀释至第七孔，第八孔为空白对照。

b.待测品孔中每孔各加入待测样品100μl,将反应板置37℃120min,用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

c.每孔加入第一抗体工作液50μl,将反应板充分混匀后置37℃60min,用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。每孔加酶标抗体工作液100μl,将反应液置在37℃60min,洗板。

d.每孔加入底物液100μl,置37℃暗处反应5-10min,每孔加入50μl终止液混匀。

e.于450nm处测定各孔od值，画出线性曲线，将样品od值带入该曲线图上查出相应大鼠tnf-α、il-1β和il-6含量。

(3)实验结果

卡萨烷粗提物对aa致炎大鼠血清中的炎症因子影响如下表所示，三种炎症因子的模型组与正常组相比均显著升高且能进一步佐证造模成功(p<0.05)。阳性对照组及样品组较模型组含量显著降低，提示卡萨烷粗提物可下调大鼠血清中的tnf-α、il-1β和il-6的含量，从而对类风湿性关节炎大鼠产生治疗作用。

各组大鼠血清tnf-α、il-1β和il-6的变化(n＝8,)

实施例5：

取各类型代表性卡萨烷二萜衍生物1、3、5、7、8、9、11、12、13、14进行巨噬细胞分泌炎症因子的活性进行测试。以考察其对免疫作用的影响。

利用脂多糖lps体外刺激小鼠巨噬细胞株raw264.7，建立活化的巨噬细胞模型。加入样品到反应时间，通过用酶联免疫分析法(elisa)检测细胞炎症因子il-1β、il-6、tnf-α的浓度。

(1)细胞培养与接种

小鼠巨噬细胞raw264.7置于37℃、5％co2的培养箱，采用含10％胎牛血清(fbs)的dmem高糖培养基进行培养；选用生长良好的raw264.7细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，含10％fbs的dmem重悬，接种于96孔培养板(每孔1×10⁵个细胞)。

(2)化合物处理细胞以及lps诱导炎症反应

lps配制：用生理盐水配制成100μg/ml的母液并过滤除菌。

给药：待细胞孵育1小时后，加入以dmso为溶剂的化合物溶液，并用培养基稀释，dmso的终浓度为0.2％。对照组加入等体积0.2％的dmso。

lps诱导：化合物处理2小时后，加入lps(2μg/ml)，继续培养24小时。阴性对照组加入同样体积的无菌生理盐水。

炎症因子测定，参照各试剂盒，结果如图1所示。

10个卡萨烷二萜衍生物对单核巨噬细胞炎症因子il-1β、il-6、tnf-α的浓度影响结果表明。各类化合物均有抑制巨噬细胞介导的类风湿、肠炎、免疫紊乱作用。