一种ETH多肽抗体及其制备方法、试剂盒与流程

本发明涉及体外诊断医学检验领域，具体而言，涉及一种eth多肽抗体及其制备方法、试剂盒。

背景技术：

肥胖与糖尿病是一系列危重疾病的危险因子，这些并发疾病包括动脉粥样硬化、心脑血管损伤、肾病以及某些癌症等。虽然其背后的分子机制尚不明确，越来越多的证据提示，脂肪慢性滴度炎症(chronicinflammation)及脂肪组织储存游离脂肪酸能力受损可能在其中起到了重要作用。

随着糖尿病人群发展的严峻形势，迫切需要有效的糖尿病及其并发症检测试剂盒，然而目前市场上相关产品缺少。常用的检测手段主要是通过以下方法：(1)血糖：是诊断糖尿病的依据，包括空腹血糖和餐后2小时血糖，血糖水平高于一定的参考值即可诊断为糖尿病。需要注意两点，一是不能忽视餐后血糖，它对早期糖尿病的诊断意义更大；二是尿糖阳性仅能作为糖尿病的诊断线索，不能作为诊断依据。(2)口服葡萄糖耐量试验(ogtt试验)：当患者空腹或餐后血糖比健康人稍高，但还没达到糖尿病的诊断标准时，就需要进一步做口服葡萄糖耐量试验，来确定究竟是糖调节受损还是糖尿病。不能为人群提供预防疾病的便利性而且不能对糖尿病及其并发症提供可靠的检测结果。因此，开发兼有使用方便，效果可靠双重作用的检测试剂盒尤其重要，并以广阔的市场前景吸引各国的研究人员的关注。

在糖尿病或肥胖状况下，胰岛素相对不足，而胰高血糖素相对过剩，致使机体处于ffa(游离脂肪酸)溢出状态。溢出的ffa在各个脏器造成脂毒性，对糖尿病并发症的发生发展产生了至关重要的影响。以心脏为例，糖尿病患者心脏大血管病变几率明显高于正常人群，其中一个主要原因在于脂肪组织溢出的ffa在心肌细胞及血管内皮细胞产生氧化应激、线粒体紊乱等危害，从而引起脂毒性，最终造成细胞损伤导致病变发生。

通过脂肪组织活检可确定是否存在慢性炎症、纤维化等问题，从而对可能发生并发症的几率进行预判，并可指导临床用药。然而，该策略的主要问题在于脂肪组织不同别的脏器，它以分散的形式出现在人体的多处，而这些脂肪块(fatdepots)在代谢中可能起到不同的作用，单独一处或者几处的组织标本很难从整体上表明脂肪组织的健康程度。

endotrophin(eth)是脂肪组织细胞外基质胶原蛋白-6的c端片段，已有证据表明eth与脂肪病变呈高度相关性，相比于其它的指标如前炎症性白细胞介素、趋化因子等，eth具有特异性强、稳定性高等优势。更为关键的，最新证据显示，除可表征脂肪组织的健康程度外，eth分子极有可能直接参与到其病变过程中。而目前针对eth多肽片段检测的方法较少。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种eth多肽抗体，该eth多肽抗体可识别eth多肽表面的两个独立抗原，其结合三明治式elisa的方法对样品中eth的含量进行检测，具有特异性强、亲和力高的特点。

本发明的另一目的在于提供一种上述eth多肽抗体的制备方法，该制备方法所制得的eth多肽抗体具有特异性强、亲和力高的特点。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测eth多肽含量的试剂盒，该试剂盒基于三明治式elisa的方法检测出样品中的eth多肽含量，具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点。

本发明是这样实现的：

一种eth多肽抗体，其包括第一抗体和第二抗体中的至少一种；

上述第一抗体由seqidno:1所示的第一抗原肽免疫动物后得到；

上述第二抗体由seqidno:2所示的第二抗原肽免疫动物后得到。

上述eth多肽抗体的制备方法，其包括：采用seqidno:1所示的第一抗原肽或seqidno:2所示的第二抗原肽免疫动物。

一种用于检测eth多肽含量的试剂盒，其包括上述eth多肽抗体。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的提供的eth多肽抗体，其包括由seqidno:1所示的第一抗原肽免疫动物后得到的第一抗体和/或由seqidno:2所示的第二抗原肽免疫动物后得到的第二抗体，第一抗体和第二抗体可分别特异性地识别eth多肽表面的抗原位点，其结合三明治式elisa的方法可对样品中eth的含量进行检测，具有特异性强、亲和力高的特点，为使用者提供了更多的检测eth多肽的手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的eth多肽在37℃条件下eth熵值最低而稳定存在的结构图；

图2为本发明实施例1提供的eth多肽标准品在室温下放置不同时间后的sds-page检测结果；

图3为本发明实施例3提供的对实施例2提供的试剂盒的线性范围检测的结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种eth多肽抗体及其制备方法、试剂盒进行具体说明。

eth多肽的氨基酸序列如seqidno：3所示，在pdb数据库中尚无eth多肽的具体晶体结构，这为设计高亲和力的抗体造成了极大的困难。本发明的发明人采用同源比对的方式，针对基质胶原蛋白-6(collagen6)家族的多个已知结构进行了比较，解析了eth可能的空间结构。附图1显示的是37℃条件下eth熵值最低而稳定存在的结构。并采用moe软件，分析了eth的相关参数。分析结果发现，作为基质胶原蛋白6a3(collagen6a3)的截断片段，虽然eth本身只有77个氨基酸组成，但其稳定性极高，可能是由于其内在的二硫键的作用。该多肽在c2-c62，c21-c4及c37-c58氨基酸间存在三对链内二硫键。其alpha螺旋的参数是60.78，可高度折叠，对水解酶有一定的抵抗。该蛋白的总分子量是8510.77da，其实测等电点是6.10。chimera分析显示eth在生理状态下以高度折叠形式存在，而eth本身分子较小，这使得抗原肽段的选择具有一定的挑战性。

本发明的发明人针对eth表面抗原采用生物信息学的方法，得到了具有抗原性的seqidno:1所示的第一抗原肽(分子量5800.47da)和seqidno:2所示的第二抗原肽(分子量5478.25da)，将第一抗原肽和第二抗原肽分别免疫动物后，得到了可特异性地识别eth多肽的第一抗体和第二抗体。

基于此，一方面，本发明提供了一种eth多肽抗体，其包括第一抗体和第二抗体中的至少一种。上述第一抗体由seqidno:1所示的第一抗原肽免疫动物后得到。上述第二抗体由seqidno:2所示的第二抗原肽免疫动物后得到。

第一抗体和第二抗体可分别识别eth多肽表面的两个独立抗原位点，再结合三明治式elisa的方法对样品中eth的含量进行检测，具有特异性强、亲和力高的特点，为使用者提供了更多的检测eth多肽手段。

第一抗体和第二抗体均为单克隆抗体。

另一方面，本发明还提供了上述eth多肽抗体的制备方法，其包括：采用seqidno:1或seqidno:2所示的抗原肽免疫动物。

seqidno:1所示的抗原肽为第一抗原肽，将其免疫动物得到第一抗体，seqidno:2所示的抗原肽为第二抗原肽，将其免疫动物得到第二抗体。

进一步地，为了提高抗原肽的抗原性，增加抗原肽的比值以使得载体蛋白相对不足，在本发明的一些实施方案中，将上述抗原肽与载体蛋白偶联，得到偶联物，再将上述偶联物免疫上述动物。

优选地，在本发明的一些实施方案中，上述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或卵清白蛋白。

优选地，在本发明的一些实施方案中，按质量比为(5～50):1的比例将上述抗原肽与上述载体蛋白进行偶联。

更选地，在本发明的一些实施方案中，按质量比为10:1的比例将上述抗原肽与上述载体蛋白进行偶联。

在上述质量比的范围将抗原肽与载体蛋白进行偶联，得到的eth多肽抗体具有更高的亲和力和更强的特异性。尤其是，按质量比为10:1的比例将上述抗原肽与上述载体蛋白进行偶联。所得的eth多肽抗体亲和力以及特异性均比较高。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该制备方法还包括：将上述偶联物与佐剂混合后免疫上述动物。

其中，上述佐剂为弗氏(freund)完全佐剂或弗氏不完全佐剂。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，采用皮下多点注射的方法进行抗原肽给予。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，免疫次数为三次。

进行初次免疫时，采用弗氏完全佐剂与偶联物混合后再进行皮下注射；其中，优选地，抗原肽使用量为1-100微克；更有选地，抗原肽使用量为20微克。

三周后，进行第二次免疫，采用弗氏不完全佐剂与偶联物混合后再进行皮下注射。

第六周，进行第三次免疫，将偶联物直接进行皮下注射，该过程中不使用佐剂。其中，优选地，抗原肽使用量为10微克。

可选地，在本发明的一些实施方案中，上述动物为小鼠、兔、鸡或羊等动物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该制备方法还包括：取免疫后的上述动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获取产抗体的杂交瘤细胞。

需要说明的是，最后一次免疫(例如第三次免疫)后一周内测定抗体效价以确定是否采用加强免疫。选定效价高的动物(例如小鼠)脾细胞，用于后续与骨髓瘤细胞融合。

可选地，在本发明的一些实施方案中，采用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。饲养细胞的制备过程可参考如下方法：取健康动物(例如balb/c小鼠)肤浅注射肉汤培养基，三天后收集腹水。室温下1000转离心10分钟，弃去上清，采用磷酸盐生理盐水洗涤沉淀细胞。重悬细胞后重复上述步骤三次。最后所得细胞采用100mm细胞培养皿在37℃恒温箱中培养，设定二氧化碳浓度为5％。培养基为dmem，所含fbs(胎牛血清)的比例为5％-20％，优选为10％。整个过程在无菌条件下进行，培养基中不添加任何抗生素。

可选地，在本发明的一些实施方案中，采用peg法将脾细胞和骨髓瘤细胞融合。

具体地，在本发明的一些实施方案中，采用peg法将脾细胞和骨髓瘤细胞融合包括：按1：2-20的比例(个数比)将骨髓瘤细胞与脾细胞混合；采用无血清培养基洗涤，室温下1000转离心10分钟，所得沉淀按上述步骤重复洗涤三次；用peg重悬沉淀，于25-50℃下孵育1-10分钟，优选为35℃；加入采用无血清培养基终止融合；所得细胞稀释后加入到细胞培养板，置于37℃恒温箱按常规方法培养。

优选地，在本发明的一些实施方案中，采用peg分子量4000、浓度为45％的peg试剂重悬沉淀。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该制备方法包括：采用hat法对融合后的细胞进行筛选，以得到阳性的产eth多肽抗体的杂交瘤细胞(即脾细胞和骨髓瘤细胞发生了融合的细胞)。

所得杂交瘤细胞细胞系可在液氮存放下存放6-12月而不降低细胞活力，所产eth多肽抗体的亲和力均保持一致，且具有特异性强、亲和力高的特点。

再一方面，本发明提供了一种用于检测eth多肽含量的试剂盒，其包括上述eth多肽抗体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第二抗体偶联有用于结合催化酶的第一连接物，上述第一连接物为生物素、地高辛和异硫氰酸荧光素中的一种。

其中，第二抗体偶联生物素的方法如下：将第二抗体的浓度控制在1-10mg/ml，按10-100：1的比例加入活化的生物素，在5-50℃下反应1-10小时。优选的，采用20：1的比例，在37℃反应60分钟。反应产物采用sepharoseg10纯化，采集最先出现的峰。合并产物后于4℃存放。该偶联产物在4℃条件下可稳定存放12-36个月，在-20℃条件下可存放5年以上。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该试剂盒还包括：培养板，催化酶、上述催化酶的底物、终止液、洗涤液以及eth多肽标准品中的一种或多种的组合。

使用时，先将第一抗体包被于培养板上，第一抗体包被于培养板的方法如下：用含0.5％triton的磷酸盐生理盐水对第一抗体进行稀释，稀释后的工作溶液按每个孔50-300微升的量加入，优选为100微升。将加入第一抗体的培养板于4℃过夜或37℃2小时后使用。其中，按1：(100-10000)的比例用生理盐水对第一抗体进行稀释，优选地，按1：1000的比例进行稀释。

其中，上述催化酶偶联有用于与第一连接物结合的第二连接物，上述第二连接物为亲和素、地高辛抗体和异硫氰酸荧光素抗体中的一种。

上述催化酶为辣根过氧化物酶(hrp)；上述底物为tmb、abts和opd中的一种。

上述终止液为磷酸溶液。

上述洗涤液为含triton的tris-hcl缓冲液。

第二抗体与生物素进行偶联，催化酶与亲和素偶联，这样，生物素-亲和素系统可以增强该检测试剂盒的灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，eth多肽标准品由seqidno:4所示的编码序列转入宿主菌中经表达、纯化后得到。

该编码序列经过了密码子偏爱性优化，gc含量控制在30-70％之内，可在大肠杆菌bl21(de3)宿主菌中高效地表达出目的蛋白eth多肽。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该试剂盒包括：

浓度为0.1-10mg/ml、体积为100μl的标记有hrp的亲和素溶液，装于1.5ml的样品管中，标记有hrp的亲和素起到信号级联放大信号的作用；

其浓度为0.01-10μg/μl，体积为100μl的tmb溶液，装于棕色样品管中避光，tmb作为报告信号分子，；

0.5-2当量的磷酸溶液10ml，作为终止液，装于20ml容量的白色塑料瓶中；

含0.5％triton的ph7.2-7.4的tris-hcl缓冲液150ml，作为洗涤液，装于200ml容量的白色塑料瓶中。

以上所有溶液在放入试剂盒前均灭菌，除终止液外的所有溶液均采用0.22微米微孔滤膜过滤灭菌。经检测，本发明提供的试剂盒可于室温下放置3-6个月，于4℃条件下放置6-12个月。

本发明提供的试剂盒基于三明治式elisa的方法检测出样品中的eth多肽含量，具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种eth多肽抗体，该eth多肽抗体包括第一抗体和第二抗体，第一抗体由seqidno:1所示的第一抗原肽免疫动物后得到，第二抗体由seqidno:2所示的第二抗原肽免疫动物后得到。

本实施例提供了eth多肽抗体中的第一抗体的制备方法如下。

1.1免疫步骤

1.1.1根据seqidno:1所示的氨基酸序列采用merrifield法合成多肽，得到第一抗原肽。

1.1.2按质量比为10:1的比例将第一抗原肽与牛血清白蛋白偶联，得到偶联物。偶联物无需进一步纯化可直接与freund佐剂混合。

在其他的实施例中，第一抗原肽与牛血清白蛋白的质量比也可以是5:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1中的任意一种，只要第一抗原肽与牛血清白蛋白的质量比在(5-50):1的比例范围内均可。

1.1.3初次免疫：以balb/c小鼠作为宿主动物，取20微克偶联物，与freund完全佐剂按体积比1:1的比例混合，采用皮下多点注射的方法进行抗原给予。以此作为时间计算起点。

1.1.4第二次免疫：三周后进行第二次皮下抗原注射，取20微克偶联物，与freund不完全佐剂按体积比1:1的比例混合，采用皮下多点注射的方法进行抗原给予。

1.1.5第三次免疫：第六周进行第三次免疫，取10微克偶联物，不采用任何佐剂，用皮下多点注射的方法进行抗原给予。

1.1.6第三次免疫后一周内测定抗体效价。选定效价高的小鼠取脾细胞，进行细胞融合。采用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。

1.2制备饲养细胞

1.2.1取健康balb/c小鼠肤浅注射肉汤培养基，三天后收集腹水。

1.2.2室温下1000转离心10分钟，弃去上清，采用磷酸盐生理盐水洗涤沉淀细胞。

1.2.3重悬细胞后重复上述步骤(1.2.2)三次。

1.2.4所得细胞采用100mm细胞培养皿在37℃恒温箱中培养，设定二氧化碳浓度为5％。所用培养基为dmem，含10％的fbs。整个过程在无菌条件下进行，培养基中不添加任何抗生素。需要说明的是，在其他的实施例中，fbs的含量可以是5％，15％，20％中的一种，只要在5-20％范围内均可。

1.3用peg法进行细胞融合

1.3.1按1：10的比例(个数比)将骨髓瘤细胞与所得免疫后小鼠的脾细胞混合。

1.3.2采用无血清培养基洗涤，室温下1000转离心10分钟，所得沉淀按上述步骤重复洗涤三次。

1.3.3采用peg分子量4000、浓度为45％的peg试剂重悬沉淀，于35℃下孵育10分钟

1.3.4加入采用无血清培养基终止融合；所得细胞稀释后加入96孔细胞培养板，置于37℃恒温箱按常规方法培养。

1.4hat法筛选

1.4.1将上述步骤得到细胞接种至hat培养基进行培养，hat培养基每24小时换一次，以减少隐性细胞死亡对阳性细胞的影响。整个筛选过程持续2-3周。

1.4.2获得阳性细胞集落即可分泌第一抗体的杂交瘤细胞，置于37℃恒温箱按常规方法培养。

1.4.3选取亲和力高的细胞集落后采用无限稀释法制备细胞系。

1.4.4细胞系采用dmem含50％血清，10％dmso培养基于-80℃预冻存过夜，然后置于液氮存放。经检测显示，所得细胞系可在该条件下存放6-12月而不降低细胞活力，且所产的抗体亲和力保持一致。

1.5第一抗体的获取

按常规方法培养得到的可分泌第一抗体的杂交瘤细胞，从培养上清液中纯化得到第一抗体。

1.6参考上述第一抗体的制备方法，用seqidno:2所示的第二抗原肽替换第一抗原肽可制得第二抗体。

实施例2

本实施例提供了一种用于检测eth多肽含量的试剂盒，其包括实施例1提供的eth多肽抗体、96孔培养板、标记有hrp的亲和素、tmb(四甲基联苯胺)、作为终止液的磷酸溶液、作为洗涤溶液的含triton的tris-hcl缓冲液、eth多肽标准品。

其中，在检测eth多肽时，需先将eth多肽抗体的第一抗体包被于96孔培养板中。第一抗体包被于培养板的方法如下：用含0.5％triton的磷酸盐生理盐水按1：1000的比例(体积比)对第一抗体进行稀释，稀释后的工作溶液按每个孔100微升的量加入。将加入第一抗体的培养板于4℃过夜后使用。

eth多肽抗体的第二抗体偶联有生物素，偶联的方法如下：将第二抗体的浓度控制在10mg/ml，按20：1的比例(体积比)加入活化的生物素，在37℃下反应60分钟。反应产物采用sepharoseg10纯化，采集最先出现的峰。合并产物后于4℃存放。经检测，该偶联产物在4℃条件下可稳定存放12-36个月，在-20℃条件下可存放5年以上。

eth多肽标准品由seqidno:4所示的编码序列转入宿主菌中经表达、纯化后得到。

eth多肽标准品的具体制备方法如下。

合成seqidno:4所示的核苷酸序列，所得dna片段与硫氧还原蛋白基因融合，采用peth32a载体做蛋白质表达。具体的，采用氨苄青霉素做抗性筛选，采用dh5细菌做最初的载体。阳性克隆抽提质粒做双酶切验证，并送至南京金斯特公司做dna序列测定。确认后的质粒转入bl21(de3)细菌中进行蛋白质表达(具体表达条件可参考《分子克隆》第三版，其方法为业内人士所熟知)。具体的，采用iptg作为诱导物，在37℃诱导4-10小时后收集细胞。细菌破碎采用超声波的方法，400瓦特功率下按5秒工作5秒休息的模式破碎5-30分钟。破碎液在4度条件下离心，按20000转20分钟条件获得上清液，该溶液中含所表达的目的蛋白(eth多肽)。

蛋白质的纯化采用单步亲和柱上切割的方法。上清液采用akta层析系统加载到hitrap层析柱，上样速度控制在1-20毫升每分钟。整个层析系统置于4℃条件下。上样结束后采用磷酸盐生理盐水洗涤，然后降肠激酶按每毫升0.1-100个单位的比例稀释，稀释后的溶液加载到层析柱上，孵育2-24小时。优选的，在本实施例中，采用0.1单位肠激酶每毫升磷酸盐生理盐水作为工作溶液，在4℃条件下孵育12小时。柱上切割后的样品采用tris-hcl作为缓冲体系进行洗脱。所得粗品进一步采用rp-hplc-c18进行纯化。洗脱相使用乙腈梯度，在本实施例中，20-80乙腈梯度在30分钟内洗脱，所得样品纯度较高。合并目标峰中的eth蛋白，采用冷冻干燥的方式进一步处理。冷冻干燥后的eth蛋白可存于室温。检测发现该冻干粉可于室温下放置12-36个月。图2(图中：1和2代表放置0天，3/4/5代表放置1个月；6/7/8代表放置2个月；9/10/11代表放置6个月；12/13/14代表放置12个月)显示了eth标准品蛋白在室温下放置不同时间后sds-page检测未出现降解等问题。由此表明采用上述制备方法所制得的eth多肽标准品较稳定，

在eth检测试剂盒中，eth多肽标准品采用冻干粉的方式放置。在具体使用时可用磷酸盐生理盐水按一定比例稀释。

亲和素溶液浓度为5mg/ml、体积为100μl的，装于1.5ml的样品管中，偶联有hrp的亲和素起到信号级联放大信号的作用。

tmb溶液浓度为5μg/μl，体积为100μl，装于棕色样品管中避光，tmb作为报告信号分子。

1当量的磷酸溶液，10ml，装于20ml容量的白色塑料瓶中。

含0.5％triton的ph7.2的tris-hcl缓冲液体积150ml，装于200ml容量的白色塑料瓶中。

经检测，本实施例提供的试剂盒的最低检测限为18μg/ml，检测范围为31.25-2000μg/ml。

实施例3

人体血浆eth含量测定

采用实施例2提供的用于检测eth多肽含量的试剂盒对人体血浆eth含量测定。

血浆标本采集自健康人群、糖尿病人群以及肥胖人群。收集5毫升血液样品，在4000转下离心5分钟，收集上层血浆，分装后于-80℃冻存。在实际检测过程中本发明的发明人发现反复冻融可造成血浆中eth蛋白的降解，为获得最佳结果，冻融次数应控制在3次以内。如样品于4℃条件下放置，需当天测定，如-80℃放置，可于30天内进行测定。

血浆稀释比例优化：采用含5％牛血清白蛋白的磷酸盐生理盐水对血浆进行稀释。为获得最佳结果，在第一次实验时需按一定比例做稀释，以测定最佳稀释比例。在具体过程中，按1：(1-1000)进行实验，发现血浆样品按1：20比例内稀释时均在检测范围内，但当稀释比例大于1：20时，由于样品中eth浓度过低，其检测的准确度收到影响。在检测人类血浆样本时，通常将血样按1：10做稀释。

检测方法如下

3.1制作标准曲线：eth多肽标准品按2000，1000，500，250，125，62.5及31.25做倍比稀释后加入包被有第一抗体的96孔培养板，每个样品需做两个复孔以增加数据的可信度。

3.2血浆样品按1：10稀释后加入包被有第一抗体的96孔培养板。加入样品的96孔培养板于室温下孵育1-10小时，优选的，本实施例中孵育2小时。

3.3孵育后的96孔培养板按每孔加洗涤液100微升，室温下放置5分钟，重复洗涤3-5次。

3.4洗涤后的培养板加入第二抗体于室温下孵育1-10小时，优选地，本实施例中孵育1小时。

3.5重复上面的步骤洗涤3次。

3.6加入偶联hrp的亲和素，于室温下放置30分钟，然后加入tmb显色5-60分钟，本实施例中为15分钟。

3.7采用终止液终止反应。在450纳米处读取吸光值。根据标准曲线计算出血液样品中的eth含量。

结果如图3所示。根据图3的结果，采用本发明提供的试剂盒的三明治法，在31.25-2000μg/mleth蛋白浓度范围内，其吸光值成线性，可用于测定血样中eth含量。

本实施例的检测结果显示，正常人群血浆eth浓度在0.5-5.0ng/ml范围内，而糖尿病及肥胖人群样本的eth含量在1.0-10.0ng/ml范围内。虽然两个人群中eth的浓度均存在分布较宽的问题，相比于正常人群，肥胖、糖尿病人群的eth含量显著增加，提示eth与代谢紊乱有一定的相关性。该检测试剂盒可用于代谢紊乱人群的检测，对疾病诊断、药品选用及精准治疗等都有一定的指导意义。

综上，本发明提供的eth多肽抗体其包括由seqidno:1所示的第一抗原肽免疫动物后得到的第一抗体和由seqidno:2所示的第二抗原肽免疫动物后得到的第二抗体，第一抗体和第二抗体可分别特异性地识别eth多肽表面的两个抗原位点，其结合三明治式elisa的方法可对样品中eth的含量进行检测，用于制备检测eth多肽含量的试剂盒，且该试剂盒是市面上首个用于检测人体eth含量的检测试剂盒，具有临床应用价值。相比于其它的指标如前炎症性白细胞介素、趋化因子等，该eth检测试剂盒具有特异性强、稳定性高等优势。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>南京谋新生物技术有限公司

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gluasnlyspheglyserglnlysglucysglulysvalcysalapro

505560

valleualalysproglyvalileservalmetglythr

657075

<210>4

<211>231

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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tgtcgtgattttattctgaagtggtactatgatccaaatacgaaatcgtgtgcccgtttt120

tggtacggtgggtgcggtggtaacgagaataagtttggaagtcagaaagaatgcgagaaa180

gtctgtgcccctgttttggcgaagcctggagtgattagtgtcatgggcact231