一种应用于防治鳗鲡病害的七星子新型单克隆抗体及其制备的制作方法

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种应用于防治鳗鲡病害的七星子新型单克隆抗体及其制备。

背景技术：

鳗鲡养殖在我国已有20多年的历史，特别是近十多年来，发展更加迅速，现已成为世界第一养鳗大国，鳗鲡是中国输出农产品中赚取外汇最多的一项。

鳗鲡养殖发展迅速，与之相比，鳗鲡病害防治技术严重滞后，鳗鲡养殖密度大，单位养殖面积的产值高，受病害的威胁比目前其他水产养殖品种都严重得多，一旦发病，往往给养殖者造成巨大的经济损失。鳗鲡疾病按病原可分为细菌性、寄生虫性、真菌性、病毒性及其他类型病原五大类，其中鳗鲡细菌性疾病为危害最严重的疾病。

为了促进包括鳗鲡在内的水产业健康发展，必须加快鱼类基础免疫学的研究，促进鱼类病原学、诊断技术和疫苗学的发展，将免疫预防手段引入到水产养殖业。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上说现有技术的缺陷和不足，开展了鳗鲡新型单克隆抗体的制备研究，将免疫学运用于鳗鲡病原诊断和流行病学研究。

本发明的目的是提供一种鳗鲡新型单克隆抗体。

本发明另一目的是提供上说鳗鲡新型单克隆抗体的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

首先，本发明提供了一种七星子可变淋巴细胞受体，即鼠抗vlr，以七星子血液淋巴细胞cdna为模板，利用引物f和引物r克隆出vlr目的基因片段，然后通过原核表达体系表达出目的蛋白vlr，然后免疫balb/c小鼠，将免疫小鼠的脾淋巴细胞与sp2/0细胞通过细胞融合，筛选得到针对vlr的单克隆抗体杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔得到单抗腹水，纯化获得七星子可变淋巴细胞受体；其中，引物f和引物r和序列分别如seqidno.1和2所示；。

具体地，是以七星子血液淋巴细胞cdna为模板，利用引物f和引物r，克隆出vlr目的基因片段，然后连接载体，转入大肠杆菌中诱导表达出目的蛋白vlr，表达菌破碎后纯化目的蛋白vlr，然后免疫balb/c小鼠，三次免疫后采血，提取纯化，获得七星子可变淋巴细胞受体，即鼠抗vlr。

本发明所制备的可变淋巴细胞受体(vlr)与igg相比有其更好的抗原识别灵敏性及更高的亲和力，vlr理化性质稳定性优于抗体分子，使其更容易保存。七星鱼与哺乳动物亲缘关系较远，vlr能够突破因哺乳动物免疫耐受而不能产生ig的限制，可以识别更广泛的抗原表位，在免疫性疾病的治疗上具有潜在的药用价值。vlr在识别并特异性结合抗原方面比已有抗体具有更强的特异性及灵敏度。

因此，所述七星子可变淋巴细胞受体在制备用于防治鳗鲡病害的七星子vlr新型单克隆抗体中的应用，也在本发明的保护范围之内。

具体地，所述鳗鲡病害是指鳗鲡爱德华氏菌病。

另外，本发明提供了一种用于防治鳗鲡病害的vlr新型单克隆抗体，是由鳗鲡igg抗体免疫七星子获得获得免疫七星子淋巴细胞，再将免疫七星子淋巴细胞与sp2/o骨髓瘤细胞进行细胞融合，利用权利要求1所述七星子可变淋巴细胞受体筛选所得杂交瘤细胞腹腔接种balb/c小鼠制备得到。

具体地，所述鳗鲡单克隆抗体是由如下方法制备得到：

s1.制备七星子可变淋巴细胞受体：

以七星子血液淋巴细胞cdna为模板，利用引物f和引物r克隆出vlr目的基因片段，然后通过原核表达体系表达出目的蛋白vlr，然后免疫balb/c小鼠，将免疫小鼠的脾淋巴细胞与sp2/0细胞通过细胞融合，间接酶联免疫吸附实验(elisa)筛选得到针对vlr的单克隆抗体杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔得到大量的单抗腹水，经proteing亲和纯化后的单抗再进行elisa与westernblotting检测无误后；最终获得七星子可变淋巴细胞受体，即鼠抗vlr；其中，引物f和引物r和序列分别如seqidno.1和2所示；

引物f(seqidno.1)：gttcgtgctcagggacagaa；

引物r(seqidno.2)：tgctaagctgggtcaggttg；

s2.制备鳗鲡igg抗体；

s3.鳗鲡igg抗体免疫七星子获得免疫七星子淋巴细胞；

s4.制备鳗鲡单克隆抗体：将免疫七星子淋巴细胞与sp2/o骨髓瘤细胞进行细胞融合获得杂交瘤细胞，利用鼠抗vlr筛选，再经过有限稀释法克隆制备单克隆细胞，扩大培养，取对数生长期细胞腹腔接种balb/c小鼠，收集腹水上清，制备获得鳗鲡单克隆抗体。

更具体优选地，所述鳗鲡单克隆抗体是由如下方法制备得到：

s1.制备鳗鲡igg抗体：

鳗鲡经爱德华氏菌免疫后，分离血清，采用cnbr-activatedsepharose纯化柱进行纯化获得igg抗体；

s2.制备七星子可变淋巴细胞受体：

以七星子血液淋巴细胞cdna为模板，利用引物f：

gttcgtgctcgggacagaa和引物r：tgctaagctgggcaggttg，克隆出目基因片段，然后连接载体，转入大肠杆菌中诱导表达出目的蛋白，表达菌破碎后纯化目的蛋白，然后免疫balb/c小鼠，三次免疫后采血，提取纯化，获得七星子可变淋巴细胞受体；

s3.鳗鲡igg免疫七星子：

鳗鲡igg首次免疫剂量为100微克，与等量弗氏完全佐剂充分乳化后腹腔注射七星子，第二次以后抗原剂量减半与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射七星子，3～4次免疫后采血，分离提取获得免疫七星子淋巴细胞；

s4.制备鳗鲡单克隆抗体：

在无菌条件将免疫七星子淋巴细胞重悬于dmem，并与sp2/o骨髓瘤细胞进行细胞融合；检测杂交瘤细胞上清，取抗体阳性细胞经过有限稀释法克隆，制备单克隆细胞，扩大培养，取对数生长期细胞腹腔接种6周龄balb/c小鼠，10d后采腹水，收集上清。

另外，上述鳗鲡单克隆抗体在作为或制备抗鳗鲡爱德华氏菌的药物方面的应用，以及在作为或制备鳗鲡爱德华氏菌病的防治药物方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种鳗鲡的新型七星子vlr单克隆抗体，该抗体对爱德华氏菌具有显著的杀菌作用，能够用于防治鳗鲡的爱德华氏菌病，且在识别和特异性结合抗原方面具有很高的特异性，灵敏性高。

而且，在本发明的方案中，可变淋巴细胞受体(vlr)与igg相比有其更好的抗原识别灵敏性及更高的亲和力，vlr理化性质稳定性优于抗体分子，使其更容易保存。七星鱼与哺乳动物亲缘关系较远，vlr能够突破因哺乳动物免疫耐受而不能产生ig的限制，可以识别更广泛的抗原表位，在免疫性疾病的治疗上具有潜在的药用价值。vlr在识别并特异性结合抗原方面比已有抗体具有更强的特异性及灵敏度。

附图说明

图1为对克隆出的目的基因的检测。

图2为目的蛋白的检测。

图3为鳗鲡igg免疫七星子后的效价检测。

图4为western-blot分析抗体特性。

图5为小鼠腹水中单克隆抗体效价检测。

图6为单克隆抗体活性检测。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1制备鳗鲡单克隆抗体

1、七星子可变淋巴细胞受体的制备

七星子体内不含ig类分子，但含有一种替代物质——可变淋巴细胞受体，可以识别更广泛的抗原表位，在识别和特异性结合抗原方面比抗体具有更强的特异性及灵敏度。

从ncbi数据库中得到其mrna序列，设计合适的引物(f：gttcgtgctcgggacagaa；r：tgctaagctgggcaggttg)，以七星子血液淋巴细胞cdna为模板，克隆出目的基因片段，结果如图1所示。

然后连接载体，转入大肠杆菌中诱导表达出目的蛋白，表达菌破碎后纯化目的蛋白，结果如图2所示，然后免疫多只balb/c小鼠，分别三次免疫后采血，提取纯化，获得鼠抗vlr(即七星子可变淋巴细胞受体)。

并对其免疫学特性进行检测，利用elisa对其进行效价检测，结果如图3所示，并利用western-blot分析后最终选择一株质量比较高的抗体用于后续实验，结果如图4所示。

2、鳗鲡igg抗体的获得：

日本鳗鲡经爱德华氏菌免疫后，分离血清，采用cnbr-activatedsepharose纯化柱进行纯化，获得igg抗体。

3、鳗鲡igg免疫七星子

纯化的日本鳗鲡igg首次免疫剂量为100微克，与等量弗氏完全佐剂充分乳化后腹腔注射七星子，第二次以后抗原剂量减半与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射七星子，3～4次免疫后断尾采血，分离提取淋巴细胞。免疫效价如图2所示。

4、单克隆抗体的制备

在无菌条件将免疫七星子淋巴细胞重悬于10mldmem，并与sp2/o骨髓瘤细胞进行细胞融合。利用鼠抗vlr，以间接elisa检测杂交瘤细胞上清，取抗体阳性孔细胞经过有限稀释法克隆，制备单克隆细胞，扩大培养，取对数生长期细胞腹腔接种6周龄balb/c小鼠，10d后采腹水，收集上清，制备获得鳗鲡单克隆抗体。

实施例2酶联免疫吸附试验(elisa)

1、筛选单克隆抗体

爱德华氏菌包被于96孔酶标板，每板50μl，4℃过夜。次日每孔滴加100μl含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs，37℃封闭2h，pbst洗5次，每次2min，然后加入1∶150稀释的鳗鲡免疫血清，37℃孵育1h；pbst洗涤后加入50μl杂交瘤细胞培养上清，37℃反应1h，最后滴加羊抗鼠igg，室温反应1h，洗涤后加tmb，37℃显色15min，用浓硫酸终止反应。sp2/o骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照。

共筛选得到稳定分泌抗体的杂交瘤细胞8株，分别命名为3d12，6a10，5e2，9b8，3g11，12d7，10h1，8g2。

2、单抗腹水效价测定

日本鳗鲡igg包被96孔酶标板，每孔50μl，4℃过夜，次日每孔滴加100μl含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs，37℃封闭2h，pbst洗5次，每次2min，加入梯度稀释的腹水抗体，室温反应2h，最后滴加羊抗鼠igg，室温反应1h，洗涤后加tmb，37℃显色15min，用浓硫酸终止反应。

效价测定的结果如图5所示。

3、单抗灵敏度测定

纯化日本鳗鲡igg起始浓度为5μg/ml开始，倍比稀释至50ng/ml，每孔50μl，4℃包被过夜，封闭后滴加腹水抗体，每孔50μl，其余步骤同上。

结果如表1所示，本发明制备的单抗具有很好的灵敏度。

表1

4、单抗特异性测定

收集罗非鱼、白鲳、胡子鲶、鳜鱼和欧洲鳗鲡血清，以及水产动物常见病原菌:气单胞菌、弧菌、爱德华氏菌、柱状屈桡杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌。待检鱼血清1000倍稀释后包被于酶标板；待检病原菌超声波破碎后包被于酶标板；50μl每孔，4℃包被过夜，封闭、洗涤后滴加杂交瘤细胞培养上清。用酶标仪记录结果。

结果如表2和表3，结果表明本发明的单抗在识别和特异性结合抗原方面具有很高的特异性。

表2

表3

实施例3单克隆抗体活性检测

将单克隆抗体，制备的爱德华氏菌特异性balb/c小鼠igg以及生理盐水分别与爱德华氏菌涂布于琼脂糖培养基中，37摄氏度培养箱中培养过夜后观察菌落生长情况并计算杀菌率。

其中，对照组为：生理盐水，实验组1为爱德华氏菌特异性balb/c小鼠igg，实验组2为vlr单克隆抗体。

结果如图6所示，结果表明与常规的igg相比，七星子vlr单克隆抗体具有更强大的杀菌能力。