具有对人C‑MET受体酪氨酸激酶的亲和性的泪脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法与流程

本申请要求2008年1月30日提交的美国临时申请第61/024,658号的优先权权益，其内容为所有目的通过引用整体并入本文。本发明涉及具有对人met受体酪氨酸激酶(c-met)或其结构域或片段的可检测的结合亲和性的人泪脂质运载蛋白(htlc)的突变蛋白。此类突变蛋白包含相应于htlc的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的序列位置中的至少一个的氨基酸置换。本发明还涉及编码此类突变蛋白的相应核酸分子和它们的产生方法。本发明进一步涉及产生此类突变蛋白的方法。最后，本发明涉及包含此类脂质运载蛋白突变蛋白的药物组合物以及所述突变蛋白的各种用途。met受体酪氨酸激酶(rtk)最初被鉴定为人原癌基因tpr-met的产物(park等人,proc.natl.acad.sci,usa,vol.84,第6379-6383页,1987)。c-met的配体被鉴定为是肝细胞生长因子(hgf)。hgf初始地被鉴定为培养的肝细胞的丝裂原。hgf与散射因子(sf)相同，散射因子是促进上皮细胞片层分散、以及三维培养物中生长的上皮的分支小管发生(tubulogenesis)的成纤维细胞衍生因子。因此，hgf/sf是引发包括有丝分裂、细胞运动性和形态发生的多种细胞应答的独特生长因子。hgf/sf和c-met在成年人的许多组织中表达。c-met蛋白最主要地在上皮细胞中表达，但也在内皮细胞、神经细胞、肝细胞、造血细胞、黑素细胞中表达。c-met很可能是最重要的膜受体之一。其活化在细胞生理学中起关键作用：有丝分裂发生、运动发生(motogenesis)、形态发生。hgf/sf看起来基本上是由间质起源的细胞产生的。当hgf/sf活化c-met时，下游被活化的第一种蛋白是grb2(生长因子受体结合蛋白2)和gab1(生长因子受体结合蛋白2相关结合蛋白1)。grb2又可能活化许多激酶途径，包括从ras到raf到mek和到mapk(丝裂原活化的蛋白激酶)的途径。gab1活化pi3k(磷酸肌醇3激酶)，pi3k活化stat3(信号传导子及转录激活子)。c-met活化还诱导β连环蛋白的活化，β连环蛋白是wnt途径的关键组分，其易位至核中并参与转录调节。hgf/c-met途径在癌症发展中起重要作用。第一通过关键致癌途径的活化(ras、pi3k/stat3、β连环蛋白)，第二通过内皮细胞增殖(新血管发生(neoangiogenesis))，第三通过增加的蛋白酶产生以及由此的导致转移的细胞解离。许多新的治疗方法是针对hgf/c-met途径，其中一些处于i或ii期临床试验。这些方法包括抗hgf单克隆抗体，诸如aveo的人源化形式av299或来自amgen的命名为amb102的完全人抗体(amg102)。另一种方法是使用充当诱饵的c-met的截短的变体。一个此类实例是来自compugen的称为cgen241的截短形式。另外，阻断c-met诱导的途径的蛋白激酶抑制剂(小分子)被用于治疗目的。此类小分子蛋白激酶抑制剂的实例包括来自arqule的arq197、来自exelixis的xl880、来自sgxpharmaceuticals的sgx523、来自supergen的mp470、或来自pfizer的pf2341066。尽管如此，仍期望有结合c-met并可例如用于治疗目的的其他可用的化合物。因此，本发明的目标是提供具有对给定靶标的高结合亲和性的人泪脂质运载蛋白突变蛋白。这一目标通过例如具有对人met受体酪氨酸激酶(c-met)或其结构域或片段的可检测的结合亲和性的人泪脂质运载蛋白(htlc)突变蛋白实现，其中此类突变蛋白包含相应于htlc的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的序列位置中的至少一个的氨基酸置换。在相关的方面，本发明提供产生人泪脂质运载蛋白的突变蛋白的方法，其中所述突变蛋白以可检测的结合亲和性结合c-met。这一方法包括：(a)使编码人泪脂质运载蛋白的核酸分子经受在天然的成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任何氨基酸序列位置的至少一个密码子处的诱变，其中编码成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置61和153处的半胱氨酸残基的密码子中的至少一个已被突变为编码任何其他氨基酸残基，从而获得编码人泪脂质运载蛋白的突变蛋白的多种核酸，(b)在表达系统中表达(a)中获得的一种或多种突变蛋白核酸分子，从而获得一种或多种突变蛋白，和(c)通过选择和/或分离富集步骤(b)中获得的并具有对met的可检测的结合亲和性的所述一种或多种突变蛋白。在此环境下，值得注意的是，发明人惊奇地发现，除去由半胱氨酸残基61和153形成的野生型泪脂质运载蛋白的结构性二硫键(在相应的天然核酸文库水平)(参阅breustedt,等人(2005),thecrystalstructureofhumantearlipocalinrevealsanextendedbranchedcavitywithcapacityformultipleligands(人泪脂质运载蛋白的晶体结构揭示具有对多种配体的容量的延伸的分支洞穴).j.biol.chem.280,484-493)提供不仅稳定折叠而且另外还能够以低的皮摩范围的亲和性结合给定的非天然配体的泪脂质运载蛋白突变蛋白。如本文所用的术语“诱变”意指被选择以使人泪脂质运载蛋白(swiss-prot数据库条目p31025)的给定的序列位置处天然存在的氨基酸可被相应天然多肽序列的此特定位置处不存在的至少一种氨基酸置换的实验条件。术语“诱变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸对序列区段长度进行的(另外)修饰。因此，例如，所选的序列位置处的一个氨基酸被一串三个随机突变置换，导致与野生型蛋白的相应区段的长度相比插入两个氨基酸残基，在本发明范围内。可在能够经受本发明所述诱变的任何肽区段彼此独立地引入此类缺失的插入。在本发明的一个示例性实施方案中，多种突变的插入可被引入到所选的脂质运载蛋白支架的环ab(参阅国际专利申请wo2005/019256，其通过引用整体并入本文)。术语“随机诱变”意指在诱变过程中，某个序列位置处不存在预定的单一氨基酸(突变)，而是至少两种氨基酸可以某种概率掺入预定的序列位置。人泪脂质运载蛋白的编码序列(redl,b.等人(1992)j.biol.chem.267,20282-20287)用作本发明选择的肽区段诱变的起始点。对于所述氨基酸位置的诱变，本领域技术人员具有用于位点定向诱变的多种公认的标准方法可供支配(sambrook,j.等人(1989)，同上)。通常使用的技术是使用合成的寡核苷酸的混合物通过pcr(聚合酶链式反应)引入突变，所述混合物具有在期望的序列位置处的简并碱基组成。例如，密码子nnk或nns(其中n＝腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶；k＝鸟嘌呤或胸腺嘧啶；s＝腺嘌呤或胞嘧啶)的使用允许在诱变过程中掺入所有20种氨基酸以及琥珀终止密码子，而密码子vvs将可能掺入的氨基酸的数目限制为12，原因是它排除了氨基酸cys、ile、leu、met、phe、trp、tyr、val被掺入到多肽序列的选择位置；在选择的序列位置的密码子nms(其中m＝腺嘌呤或胞嘧啶)的使用，例如，将可能的氨基酸数目限制为11，原因是它排除了氨基酸arg、cys、gly、ile、leu、met、phe、trp、val被掺入到选择的序列位置。在这一方面，值得注意的是，其他氨基酸(不是常见的20种天然存在的氨基酸)诸如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸的密码子也可被掺入到突变蛋白的核酸。如wang,l.,等人(2001)science292,498-500，或wang,l.和schultz,p.g.(2002)chem.comm.1,1-11所述，使用通常被识别为终止密码子的“人工”密码子诸如uag来插入其他不常见的氨基酸例如o-甲基-l-酪氨酸或p-氨基苯丙氨酸也是可能的。使用具有降低的碱基对特异性的核苷酸建筑块例如肌苷、8-氧-2'脱氧鸟苷或6(2-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3,4-二氢-8h-嘧啶-1,2-噁嗪-7-酮(zaccolo等人(1996)j.mol.biol.255,589-603)是向所选的序列区段引入突变的另一个选择。另一种可能是所谓的三联体诱变。此方法使用不同的核苷酸三联体的混合物，每种核苷酸三联体编码要掺入编码序列的一种氨基酸(b,gel,plückthuna,schneiderkc,wellnhoferg,moroneyse.1994trinucleotidephosphoramidites:idealreagentsforthesynthesisofmixedoligonucleotidesforrandommutagenesis(三核苷酸亚磷酰胺：合成用于随机诱变的混合寡核苷酸的理想试剂).nucleicacidsres22,5600-5607)。在相应多肽的选择区域引入突变的一种可能策略是基于使用四种寡核苷酸，每种寡核苷酸部分衍生自要突变的相应序列区段之一。当合成这些寡核苷酸时，本领域技术人员可采用用于合成相应于要突变的氨基酸位置的那些核苷酸三联体的核酸建筑块的混合物，以便随机产生编码所有天然氨基酸的密码子，这最终造成脂质运载蛋白肽文库的产生。例如，序列中远离突变的位置的第一寡核苷酸相应于脂质运载蛋白多肽的最n-末端位置处要突变的肽区段的编码链。因此，第二寡核苷酸相应于多肽序列中接下来的第二序列区段的非编码链。第三寡核苷酸依次相应于相应的第三序列区段的编码链。最后，第四寡核苷酸相应于第四序列区段的非编码链。可使用相应的第一和第二寡核苷酸以及如果需要，单独地使用相应的第三和第四寡核苷酸，进行聚合酶链式反应。这两种反应的扩增产物可通过多种已知的方法合并成包含从第一序列区段至第四序列区段的序列的单一核酸，其中已在选择的位置引入突变。为此目的，例如，可使两种产物都经受使用贡献第二序列区段和第三序列区段之间的序列的侧翼寡核苷酸以及一种或多种中介(mediator)核酸分子的新的聚合酶链式反应。在选择用于诱变的寡核苷酸序列内的数目和排列时，本领域技术人员具有许多可选方案可供支配。上文定义的核酸分子可通过连接(ligation)编码脂质运载蛋白多肽和/或载体的核酸的缺乏5'和3'的序列连接，并可在已知的宿主生物体中克隆。有多种可得的用于连接和克隆的公认程序(sambrook,j.等人(1989)，同上)。例如，可将克隆载体序列中还存在的限制性核酸内切酶识别序列加工到合成的寡核苷酸的序列中。因此，在扩增相应的pcr产物和酶促切割之后，可使用相应的识别序列容易地克隆所得的片段。编码选择用于诱变的蛋白的基因内的更长的序列区段也可通过已知方法经受随机诱变，例如通过使用具有增加的错误率的条件下的聚合酶链式反应、通过化学诱变或通过使用细菌突变基因菌株。此类方法还可用于脂质运载蛋白突变蛋白的靶标亲和性或特异性的进一步优化。可能发生在实验诱变区段以外的突变通常是耐受的，或甚至可证明是有利的，例如如果它们有助于脂质运载蛋白突变蛋白的改善的折叠效率或折叠稳定性。如本文所用的术语“人泪脂质运载蛋白”指成熟的人泪脂质运载蛋白，其以登录号p31025保藏于swiss-prot数据库，并且其氨基酸序列在本文以seqidno:36表示。在本发明的一个实施方案中，用于产生人泪脂质运载蛋白的突变蛋白的方法包括突变成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的任何位置的密码子中的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16或17个。在另一实施方案中，成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106和108的所有18个密码子是突变的。因此，本发明的met结合突变蛋白可包含成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16、17或18个位置中任何位置处的突变。然而，本领域技术人员清楚，使序列位置经受诱变并不一定意味着所选的可能氨基酸置换将确实发生于本发明的突变蛋白中。由于回复突变或结构-功能关系，野生型泪脂质运载蛋白序列的氨基酸残基也可保留在本发明的突变蛋白中。在另一方面，本发明包括产生人泪脂质运载蛋白的突变蛋白的方法，其中所述突变蛋白以可检测的结合亲和性结合作为人泪脂质运载蛋白的给定的非天然配体的c-met，包括：(a)使编码人泪脂质运载蛋白的核酸分子经受成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置34、80和104中任何位置的至少一个密码子的诱变，从而获得编码人泪脂质运载蛋白的突变蛋白的多种核酸，(b)在表达系统中表达(a)中获得的一种或多种突变蛋白核酸分子，从而获得一种或多种突变蛋白，和(c)通过选择和/或分离富集步骤(b)中获得的并具有对作为人泪脂质运载蛋白的给定的非天然配体的c-met的可检测的结合亲和性的所述一种或多种突变蛋白。在前述方法的一个实施方案中，成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26-33、56-58、83、105-106和108的任何位置的密码子中的另外至少2、3、4、5、6、8、10、12、14或15个是突变的。在本发明的进一步实施方案中，根据本发明的方法包括编码成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列中的位置61和153处的半胱氨酸的两个密码子的突变。两个位置均可，例如，被突变为编码丝氨酸残基。在如本文所述的本发明的另一实施方案中，编码成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置111和/或114的密码子被突变为编码例如位置111处的脯氨酸和位置114处的色氨酸。本发明的方法的另一实施方案包括诱变编码成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的位置101处的半胱氨酸的密码子以使此密码子编码任何其他氨基酸。在一个实施方案中，编码位置101的突变的密码子编码丝氨酸。因此，在一些实施方案中，位置61、101和153处的任两个或所有三个半胱氨酸密码子被另一氨基酸的密码子置换。根据本发明的方法，以编码人泪脂质运载蛋白的核酸为起点获得突变蛋白。此类核酸经受诱变并通过重组dna技术被引入到合适的细菌或真核宿主生物体。获得泪脂质运载蛋白的核酸文库可使用本领域已知的任何合适的技术进行，以产生具有抗体样性质的脂质运载蛋白突变蛋白，即具有对给定的靶标的亲和性的突变蛋白。例如，此类组合方法的实例详细地描述于国际专利申请wo99/16873、wo00/75308、wo03/029471、wo03/029462、wo03/029463、wo2005/019254、wo2005/019255、wo2005/019256、wo2006/56464或国际专利申请pct/ep2007/057971，其公开内容通过引用完全并入本文。在适当的宿主中表达经受诱变的核酸序列之后，可从获得的文库中选择携带结合给定的靶标的多种相应脂质运载蛋白突变蛋白的遗传信息的克隆。例如，可采用公知的技术选择这些克隆，诸如噬菌体展示(综述参见：kay,b.k.等人(1996)同上；lowman,h.b.(1997)同上，或rodi,d.j.和makowski,l.(1999)同上)、菌落筛选(综述参见pini,a.等人(2002)comb.chem.highthroughputscreen.5,503-510)、核糖体展示(综述参见amstutz,p.等人(2001)curr.opin.biotechnol.12,400-405)或如wilson,d.s.等人(2001)proc.natl.acad.sci.usa98,3750-3755中报道的mrna展示或特别描述于wo99/16873、wo00/75308、wo03/029471、wo03/029462、wo03/029463、wo2005/019254、wo2005/019255、wo2005/019256、wo2006/56464或国际专利申请pct/ep2007/057971中的方法，其公开内容通过引用完全并入本文。根据本公开内容，获得结合c-met的泪脂质运载蛋白突变蛋白的方法的步骤(c)在上述方法的另一实施方案中还包括：(i)提供c-met或其结构域或片段作为给定的配体，(ii)使所述多种突变蛋白与所述配体接触，以允许在所述配体和具有对所述配体的结合亲和性的突变蛋白之间形成复合物，和(iii)除去没有或基本上没有结合亲和性的突变蛋白。对于结合c-met的泪脂质运载蛋白突变蛋白的产生，可使人met受体酪氨酸激酶(c-met)的胞外结构域的任何部分(例如，片段或单个结构域)或完整的胞外结构域(包含n-末端氨基酸残基1甲硫氨酸-苏氨酸932的成熟的完整受体(swissprot:p08581)与编码这些突变蛋白的(天然)核酸文库的表达获得的(多种)突变蛋白接触。可以使用商业可获得的胞外结构域，例如提供为经由例如多肽连接体融合于人igg的fc区的残基1-932(r&dsystems,usa,目录号358-mt)。可用于获得本文描述的突变蛋白的c-met片段的进一步实例包括但不限于，如stamos等人,theembojournalvol.23,no.12,2004,第2325-2335页所述的含有七个sema结构域的由met的残基25至567组成的片段，或包含残基25至567的更大片段。如果猜测本发明的突变蛋白与hgf竞争结合sema结构域，可使用结合sema结构域的片段。此类突变蛋白可(但不一定必须具有，参见实施例)hgf的拮抗剂。如果要避免与sema结构域的结合，也可以使用片段，诸如包含残基568至932的片段。也可以使用片段或其他结构域诸如c-met的psi结构域或igg-样结构域进行筛选。对于筛选目的，还可以使用，例如，黑猩猩同系物(黑猩猩(pantroglodytes)，与人c-met具有99％同一性)、猕猴属同系物(猕猴(macacamulatta)，98％同一性)、犬直向同源物(家犬(canisfamiliaris)，88％同一性)、小鼠直向同源物(swissprot:a1a597，87％同一性)或大鼠直向同源物(大鼠(rattusnorvegicus)，86％同一性)代替人c-met(的胞外结构域)。例如，如果期望突变蛋白在人和小鼠或大鼠直向同源物(或，例如胞外结构域)之间具有交叉反应性，可采取此类方法。如从上文明显的，可在本发明中产生可具有对hgf的拮抗剂作用的泪脂质运载蛋白的突变蛋白。可选地，突变蛋白可具有相应的非拮抗结合模式(参阅此方面的实施例)。在本发明方法的一个实施方案中，步骤(c)中的选择在竞争条件下进行。如本文所用的竞争条件意指突变蛋白的选择可包括至少一个以下步骤：其中突变蛋白和人泪脂质运载蛋白的给定的非天然配体(靶标)的接触是在存在与突变蛋白竞争结合靶标的另外配体诸如hgf下进行的。这一另外配体可以是c-met的生理配体诸如hgf，或c-met的任何其他非生理配体诸如抗-c-met抗体或小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂，所述抑制剂至少结合与本发明的突变蛋白识别的表位重叠或部分重叠的表位，并因此干扰所述突变蛋白的靶标结合。可选地，这一另外配体可通过变构效应通过复合不同于突变蛋白的c-met结合位点的表位来竞争突变蛋白的结合。使用温和的m13噬菌体的噬菌体展示技术的实施方案(综述参见kay,b.k.等人(1996)，同上；lowman,h.b.(1997)同上或rodi,d.j.和makowski,l.(1999)，同上)作为可用于本发明的选择方法的实例给出。可用于本发明突变蛋白的选择的噬菌体展示技术的另一实施方案(参见“实验部分”)是由broders等人(broders等人(2003)“hyperphage.improvingantibodypresentationinphagedisplay(hyperphage，改善噬菌体展示中的抗体呈递).”methodsmol.biol.205:295-302)描述的hyperphage噬菌体技术。也可使用其他温和噬菌体诸如f1或裂解性噬菌体诸如t7。对于示例性选择方法，产生了m13噬菌粒，其允许以与n-末端的信号序列优选地ompa-信号序列的融合蛋白，以及与能够在c-末端掺入噬菌体壳体的噬菌体m13壳体蛋白piii或其片段的融合蛋白形式表达突变的脂质运载蛋白核酸序列。优选地使用包含野生型序列的氨基酸217至406的噬菌体壳体蛋白的c-末端片段δpiii来产生融合蛋白。在一个实施方案中，特别优选的是piii的c-末端片段，其中位置201处的半胱氨酸残基缺失或被另一氨基酸置换。因此，本发明方法的进一步实施方案包括将编码3'端诱变获得的多种人泪脂质运载蛋白的突变蛋白的核酸与编码m13-家族的丝状噬菌体外壳蛋白piii或编码此外壳蛋白的片段的基因可操作地融合，以选择结合c-met的至少一种突变蛋白。所述融合蛋白可包含另外的组分，诸如亲和性标签，其允许固定、检测和/或纯化融合蛋白或其部分。此外，终止密码子可位于编码脂质运载蛋白或其突变蛋白的序列区和噬菌体壳体基因或其片段之间，其中在合适的抑制菌株中，所述终止密码子，优选地琥珀终止密码子，在翻译过程中至少部分地被翻译成氨基酸。例如，国际专利申请pct/ep2007/057971中描述的噬粒载体ptlpc27，现在也称为ptlc27，可用于制备编码人泪脂质运载蛋白突变蛋白的噬菌粒文库。编码泪脂质运载蛋白突变蛋白的本发明核酸分子可使用两个bstxi限制位点插入到载体中。连接后，用得到的核酸混合物转化合适的宿主菌株诸如大肠杆菌(e.coli)xl1-blue以产生大量独立的克隆。如果需要，可产生相应的载体来制备hyperphagemid文库。可选地，任何其他合适的噬菌粒载体诸如，例如本申请的实施例中使用的载体ptlpc59(参见实施例1和图1)也可用于制备噬菌粒文库。除了用于噬菌体展示的文库基因构建体被置于lacp/o而不是tetp/o控制之下并遗传融合于vcsm13噬菌体的全长基因iii之外，载体ptlpc59与载体ptlc27相同。得到的文库可随后在液体培养物中用适当的m13-辅助噬菌体或hyperphage重复感染(superinfected)以产生有功能的噬菌粒。重组噬菌粒在其表面将脂质运载蛋白突变蛋白展示为与外壳蛋白piii或其片段的融合，而融合蛋白的n-末端信号序列被正常地切割。在另一方面，它还带有由辅助噬菌体提供的一个或多个拷贝的天然壳体蛋白piii，并因此能够感染受者，通常是携带f-或f'-质粒的细菌菌株。在hyperphage展示的情况下，hyperphagemid在它们的表面上将脂质运载蛋白突变蛋白展示为与感染性外壳蛋白piii而不是天然壳体蛋白的融合。在用辅助噬菌体或hyperphage感染过程中或之后，可诱导脂质运载蛋白突变蛋白和壳体蛋白piii之间的融合蛋白的基因表达，例如通过添加去水四环素。选择诱导条件以使获得的噬菌粒的显著分数在它们的表面上展示至少一种脂质运载蛋白突变蛋白。在hyperphage展示的情况下，诱导条件得到携带由脂质运载蛋白突变蛋白和壳体蛋白piii组成的三到五种融合蛋白的hyperphagemid群体。已知用于分离噬菌粒的多种方法，诸如用聚乙二醇沉淀。分离通常在6-8小时的孵育时间段之后发生。分离的噬粒然后可通过与所需的靶标(即c-met的胞外结构域或其部分或片段)孵育而经受选择，其中所述靶标以至少允许暂时固定那些在其外壳中携带作为融合蛋白的具有所需的结合活性的突变蛋白的噬菌粒的形式呈递。在本领域技术人员已知的多种实施方案中，靶标可以，例如，与载体蛋白诸如血清白蛋白轭合并经由此载体蛋白结合于蛋白结合表面，例如聚苯乙烯。适于elisa技术或所谓的“免疫棒”(immuno-sticks)的微滴定板可优选地用于靶标的此类固定。可选地，可以使用靶标与其他结合基团诸如生物素的轭合物。然后可将靶标固定在选择性结合此基团的表面上，例如用链霉亲和素、中性链亲和素或亲和素包被的微滴定板或顺磁颗粒。如果靶标融合于免疫球蛋白的fc部分，固定还可以用例如以蛋白a或蛋白g包被的微滴定板或顺磁颗粒的表面实现。表面上存在的非特异性噬菌粒结合位点可用封闭溶液饱和，因为这是elisa方法已知的。然后通常使噬菌粒与表面上固定的靶标在生理缓冲液存在下接触。通过多次洗涤除去未结合的噬菌粒。然后洗脱表面上剩余的噬菌粒颗粒。对于洗脱，若干种方法是可能的。例如，噬菌粒可通过加入蛋白酶或在酸、碱、去污剂或离液盐的存在下或在中等变性条件下洗脱。优选的方法是使用ph2.2的缓冲液洗脱，其中洗脱物可随后被中和。可选地，可加入游离靶标(即c-met的胞外结构域或其部分或片段)的溶液以与固定的靶标竞争结合噬菌粒，或靶标特异性噬菌粒可通过与免疫球蛋白或特异性结合感兴趣的靶标的天然配体蛋白竞争而洗脱。之后，用洗脱的噬菌粒感染大肠杆菌细胞。可选地，可从洗脱的噬菌粒中提取核酸并将其用于序列分析、扩增或另一种方式的细胞转化。这样，从获得的大肠杆菌克隆开始，根据上文所述方法，通过用m13辅助噬菌体或hyperphage重复感染再次产生了新鲜的噬菌粒或hyperphagemid，并且这样扩增的噬菌粒再次经受在固定的靶标上的选择。通常需要多个选择循环以获得充分富集的形式的具有本发明突变蛋白的噬菌粒。选择循环的次数优选地选择为使在随后的功能分析中，至少0.1％的研究克隆产生具有对给定的靶标的可检测的亲和性的突变蛋白。为此，取决于所采用的文库的大小，即复杂度，通常需要2至8个循环。对于选择的突变蛋白的功能分析，然后可用从选择循环中获得的噬菌粒感染大肠杆菌菌株，并分离相应的双链噬粒dna。从此噬粒dna或另外从提取自噬菌粒的单链dna开始，可通过本领域已知的方法确定选择的本发明突变蛋白的核酸序列，并可由此推断氨基酸序列。可将突变的区域或完整的泪脂质运载蛋白突变蛋白的序列亚克隆到另一表达载体上并在合适的宿主生物体中表达。例如，国际专利申请pct/ep2007/057971中描述的载体ptlc26可用于在大肠杆菌菌株诸如大肠杆菌tg1中进行表达。由此产生的泪脂质运载蛋白的突变蛋白可通过多种生物化学方法纯化。例如用ptlc26产生的泪脂质运载蛋白突变蛋白在其c末端携带亲和性肽ii(schmidt等人，同上)，并因此可优选地通过链霉亲和素亲和层析纯化。选择还可借助其他方法进行。许多相应的实施方案是本领域技术人员已知的或描述于参考文献中。而且，可应用方法的组合。例如，通过“噬菌体展示”选择或至少富集的克隆可另外经受“克隆筛选”。这一程序具有可直接分离产生具有对c-met或例如c-met的胞外结构域的可检测的结合亲和性的泪脂质运载蛋白突变蛋白的单个克隆的优势。在“噬菌体展示”技术或“菌落筛选”方法中，除了使用大肠杆菌作为宿主生物体之外，其他细菌菌株、酵母或昆虫细胞或哺乳动物细胞也可用于此目的。继如上所述的从随机(天然)文库中选择泪脂质运载蛋白突变蛋白之外，也可应用包括限制诱变的进化方法，以在反复的筛选循环之后优化已经拥有对靶标的一定结合活性的突变蛋白对靶标的亲和性或特异性。选择具有对c-met或其结构域或片段的亲和性的突变蛋白之后，还可以使此类突变蛋白经受另一诱变，以接着选择具有甚至更高的亲和性的变体或具有改善的性质的变体，所述改善的性质诸如更高的热稳定性、改善的血清稳定性、热动力学稳定性、改善的溶解性、改善的单体行为、改善的对热变性、化学变性、蛋白酶解或去污剂等的抗性。此进一步诱变，其在旨在更高亲和性的情况下可被视为体外“亲和性成熟”，可通过基于理性设计或随机突变的位点特异性突变实现。获得更高的亲和性或改善的性质的另一可能的方法是使用易错pcr，其在脂质运载蛋白突变蛋白的选择范围的序列位置上造成点突变。易错pcr可根据任何已知的方案进行，诸如由zaccolo等人(1996)j.mol.biol.255,589-603描述的方案。适于此类目的的其他随机诱变方法，包括murakami,h等人(2002)nat.biotechnol.20,76-81描述的随机插入/缺失(rid)诱变或bittker,j.a等人(2002)nat.biotechnol.20,1024-1029描述的非同源随机重组(nrr)。如果需要，亲和性成熟也可根据wo00/75308或schlehuber,s.等人,(2000)j.mol.biol.297,1105-1120中描述的程序进行，其中获得了具有对地高辛的高亲和性的后胆色素结合蛋白的突变蛋白。改善亲和性的进一步方法是进行位置饱和诱变。在此方法中，可产生“小”核酸文库，其中仅在本文定义的四个环状区段(参阅实施例21)中的任何区段内的单一位置处引入氨基酸交换/突变。然后使这些文库直接经受选择步骤(亲和性筛选)，而无进一步的淘选轮次。此方法允许鉴定有助于所需靶标的改善的结合的残基，并允许鉴定对于结合重要的“热点”。使用此类方法，鉴定例如前两个区段(序列位置24-36或56-58)内的关键残基是可能的。在进一步的方面，本发明涉及具有对c-met或其结构域或部分的可检测的结合亲和性的人泪脂质运载蛋白的突变蛋白，其是通过上文详述的本发明方法可获得的或获得的。在一个实施方案中，根据上文方法获得的人泪脂质运载蛋白的突变蛋白包括序列位置61和153中的每个位置处存在的半胱氨酸残基中的至少一个或两个被另一氨基酸置换和成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任何一个位置处的至少一个氨基酸残基的突变。位置24-36包含在泪脂质运载蛋白的β-桶结构的开口端处结合位点的ab环中，位置53-66包含在cd环中，位置69-77包含在ef环中，而位置103-110包含在gh环中。本文中使用的这四个环的定义是根据flower(flower,d.r.(1996)，同上和flower,d.r.等人(2000)，同上)。通常，此类突变蛋白包含在成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108处的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16、17或18个突变的氨基酸残基。在一个具体实施方案中，突变蛋白包含氨基酸置换cys61→ala、phe、lys、arg、thr、asn、tyr、met、ser、pro或trp和cys153→ser或ala。已证明此类置换可用于防止连接cys61和cys153的天然存在的二硫桥的形成，并因此促进突变蛋白的操纵。在又一实施方案中，突变蛋白包含选自arg111→pro和lys114→trp的至少一个另外的氨基酸置换。本发明的突变蛋白还可包含天然成熟的人泪脂质运载蛋白序列的位置101处的半胱氨酸被另一氨基酸置换。这一置换可以例如是突变cys101→ser或cys101→thr。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可包含突变的氨基酸序列位置之外的野生型(天然)氨基酸序列。另一方面，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白还可含有经受诱变的序列位置之外的氨基酸突变，只要那些突变不干扰突变蛋白的结合活性和折叠。此类突变可使用公认的标准方法在dna水平上非常容易地完成(sambrook,j.等人(1989)molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆实验室手册),第二版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny)。氨基酸序列的可能改变是插入或缺失以及氨基酸置换。此类置换可以是保守的，即氨基酸残基被化学上相似的氨基酸残基置换。保守置换的实例是下列组的成员之间的置换：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可在氨基酸序列中引入非保守变化。此外，除了取代单一氨基酸残基，也可插入或缺失泪脂质运载蛋白的一级结构的一个或多个连续氨基酸，只要这些缺失或插入造成稳定折叠的/有功能的突变蛋白(参见例如，实验部分，其中产生了具有截短的n-和c-末端的突变蛋白)。氨基酸序列的此类修饰包括单一氨基酸位置的定向诱变，以通过掺入某些限制酶的切割位点来简化突变的脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外，还可掺入这些突变以进一步改善脂质运载蛋白突变蛋白对给定的靶标的亲和性。此外，可引入突变以调节突变蛋白的某些特性，诸如改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白抗性或水溶解性，或如果需要，降低聚集倾向。例如，天然存在的半胱氨酸残基可被突变为其他氨基酸以防止二硫桥形成。但是，也可以故意将其他氨基酸序列位置突变为半胱氨酸以引入新的反应基团，例如用于轭合至其他化合物，诸如聚乙二醇(peg)、羟乙基淀粉(hes)、生物素、肽或蛋白，或用于形成非天然存在的二硫桥。此类突变将半胱氨酸残基引入人泪脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列的示例性可能情况包括以下置换：thr40→cys、glu73→cys、arg90→cys、asp95→cys、lys121→cys、asn123→cys和glu131→cys。在氨基酸位置40、73、90、95、121、123和/或131中的任何位置的侧链处的产生的硫醇部分可用于使突变蛋白peg化或hes化，例如，用来增加相应泪脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期。其中在任何这些序列位置引入了半胱氨酸的突变蛋白s244.2-h08(参见实施例9)是本发明的此类突变蛋白的例证性实例。任何半胱氨酸残基的侧链不但可以理所当然地用于轭合增加血清半衰期的化合物，而且也可用于轭合任何需要的轭合配偶体，诸如有机分子、酶标记物、毒素、细胞抑制剂、药学上合适的放射活性标记物、荧光标记物、生色标记物、发光标记物、半抗原、地高辛、生物素、金属配合物、金属或胶体金，仅举几个有共鸣的实例。可使用本领域已知的任何常规偶联方法进行轭合(参见例如实施例18，其中半胱氨酸残基可被诸如三[2-羧基乙基]膦(tcep)或二硫苏糖醇(dtt)的试剂活化，并且然后进一步与诸如3-n-马来酰亚胺-6-肼吡啶盐酸盐(hynic)的试剂反应。本发明还包括如上文定义的截短的突变蛋白(即片段)，其中，例如，成熟的人泪脂质运载蛋白的序列的前四个n-末端氨基酸残基(his-his-leu-leu；位置1-4)和/或成熟的人泪脂质运载蛋白的序列的最后两个c-末端氨基酸残基(ser-asp；位置157-158)已被缺失(另参阅实施例和所附的序列表)。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够以可检测的亲和性，即以至少200nm的解离常数，结合期望的靶标，即c-met受体酪氨酸激酶或其结构域或片段。在一些实施方案中，本发明优选地是以对给定的靶标的至少100、20、1nm或甚至更低的解离常数结合期望的靶标的脂质运载蛋白突变蛋白。突变蛋白对期望的靶标的结合亲和性可通过多种方法测量，诸如荧光滴定、竞争elisa或表面等离子体共振(biacore)。技术人员非常清楚，复合物形成取决于许多因素，诸如结合配偶体的浓度、竞争物的存在、缓冲系统的离子强度等。选择和富集通常在允许分离在与期望的靶标(c-met或其结构域或片段)的复合物中具有至少200nm的解离常数的脂质运载蛋白突变蛋白的条件下进行。但是，洗涤和洗脱步骤可在不同严格性下进行。关于动力学特性的选择也是可能的。例如，选择可以在有利于靶标与突变蛋白形成复合物的条件下进行，突变蛋白显示从靶标的缓慢解离，或换言之，低的k解离(koff)速率。可选地，选择可在有利于在突变蛋白和靶标之间快速形成复合物或换言之高的k结合(kon)速率的条件下进行。作为进一步的例证性可选方案，筛选可在为突变蛋白的改善的热稳定性(与野生型泪脂质运载蛋白或已经对预先选择的靶标具有亲和性的突变蛋白相比)或为突变蛋白的ph稳定性而选择的条件下进行。本发明的泪脂质运载蛋白突变蛋白通常以单体蛋白存在。但是本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够自发地二聚化或形成更高的寡聚体也是可能的。虽然对于一些应用，使用形成稳定单体的脂质运载蛋白突变蛋白可能是优选的，如因为更快的扩散和更好的组织穿透，但是在其他情况下，使用自发地形成稳定的同型二聚体或多聚体的脂质运载蛋白突变蛋白可能是有利的，因为此类多聚体可提供对给定的靶标的(进一步)增加的亲和性和/或亲和力。此外，脂质运载蛋白突变蛋白的寡聚体形式可具有更慢的解离速率或延长的血清半衰期。如果需要使形成稳定单体的突变蛋白二聚化或多聚化，这可例如通过将相应的寡聚化结构域诸如jun-fos结构域或亮氨酸拉链融合至本发明的突变蛋白或通过使用“duocalins”(另参见下文)而实现。本发明的泪脂质运载蛋白突变蛋白可用于与c-met或其结构域或片段形成复合物，例如，在体外形成复合物以用于活体外诊断目的，或在体内形成复合物以用于治疗目的。一般而言，如本文所用的术语“片段”在关于c-met时涉及n-末端和/或c-末端缩短的蛋白或肽配体，其保留了全长配体被根据本发明的突变蛋白识别和/或结合的能力。术语“结构域”在涉及c-met时应根据本领域使用的常规含义进行理解。例如，术语“结构域”包含由stamos等人,theembojournal,vol.23,第2325-2335页,2004在结构上限定的sema结构域(参见例如stamos等人的图3a或图4)、psi结构域、igg-样结构域、跨膜结构域或另外的由schiering等人,proc.natl.acad.sciusa,vol.100,no.22,第12654-12659页,2003)在结构上限定的酪氨酸激酶结构域。术语“结构域”还包含由全长受体蛋白的残基met1至thr932形成的完整的c-met胞外部分，或由例如全长受体的残基2、3、4、5、6至残基920、925、930或931形成的截短的片段。如上文提及的，通过使用例如完整的胞外结构域或仅一些胞外结构域例如sema结构域，可以产生结合hgf结合位点(并且随之可能具有对于hgf的拮抗剂结合模式)的突变蛋白或另外的具有关于hgf结合的非拮抗剂结合模式的突变蛋白。在本文中，还注意到相应的突变蛋白和c-met或其结构域或片段之间的复合物形成受到许多不同因素的影响，诸如相应结合配偶体的浓度、竞争物的存在、使用的缓冲液系统的ph和离子强度以及用于确定解离常数kd的实验方法(例如荧光滴定、竞争elisa或表面等离子体共振，仅举几个例子)或者甚至用于评估实验数据的数学算法。因此，技术人员还清楚，取决于用于确定特定脂质运载蛋白突变蛋白对给定的配体的亲和性的方法和实验设置，本文给出的kd值(相应突变蛋白和其配体之间形成的复合物的解离常数)可能在某些实验范围内变化。这意味着，取决于，例如，kd是通过表面等离子体共振(biacore)或通过竞争elisa确定，测量的kd值或公差范围可存在轻微的偏差。在本发明的具体实施方案中，相对于成熟的人泪脂质运载蛋白的氨基酸序列，泪脂质运载蛋白突变蛋白包含相对于成熟的人泪脂质运载蛋白的氨基酸序列的至少6、8、10、12、14、16或17个氨基酸置换，其选自由以下组成的组：arg26→thr、val、pro、ser、gly；glu27→gln、gly、val、ser；phe28→met、asp；pro29→leu、ile、ala、trp；glu30→leu、gly、arg、phe；met31→ser；asn32→leu、arg、val、gln；leu33→tyr、val、ile、thr、phe；glu34→val、arg、ala；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile、val；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly。在一个更具体的实施方案中，本发明的突变蛋白还包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸置换：thr37→ser；met39→ile、leu；asn48→ser；lys52→thr、met；met55→leu；lys65→arg、leu；ala79→leu、ser；ala86→thr；和ile89→ser、gln、thr、his。在另一更具体的实施方案中，突变蛋白包含以下氨基酸置换：arg26→thr；glu27→gln；glu30→leu；met31→ser；asn32→leu；leu33→tyr；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly。在本发明的又一更具体的实施方案中，本发明的突变蛋白包含以下氨基酸置换：met31→ser；leu56→asn；ile57→gln；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly。在其他实施方案中，本发明的突变蛋白可包含下列氨基酸置换组之一：(1)arg26→thr；glu27→gln；phe28→met；glu30→leu；met31→ser；asn32→leu；leu33→tyr；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(2)arg26→thr；glu27→gln；phe28→asp；glu30→leu；met31→ser；asn32→leu；leu33→tyr；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→val；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(3)arg26→thr；glu27→gln；phe28→asp；glu30→leu；met31→ser；asn32→leu；leu33→tyr；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(4)arg26→val；glu27→gly；phe28→asp；pro29→leu；glu30→gly；met31→ser；asn32→arg；leu33→val；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(5)arg26→pro；glu27→gly；phe28→asp；pro29→ile；glu30→arg；met31→ser；asn32→leu；leu33→ile；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(6)arg26→ser；phe28→asp；pro29→ala；glu30→phe；met31→ser；asn32→val；leu33→thr；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(7)arg26→val；glu27→val；phe28→asp；pro29→trp；glu30→arg；met31→ser；asn32→gln；leu33→val；glu34→arg；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；以及(8)arg26→gly；glu27→ser；phe28→asp；pro29→trp；met31→ser；asn32→val；leu33→phe；glu34→ala；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly。结合c-met或其结构域或片段的人泪脂质运载蛋白突变蛋白可包含如seqidno.：1、seqidno：4-9、seqidno：22-26或seqidno：32-35和37-49中任一所列的氨基酸序列的任一种或其片段或变体，或基本上由所述氨基酸序列或其片段或变体组成，或由所述氨基酸序列或其片段或变体组成。在一个实施方案中，根据本发明的突变蛋白包含如seqidno：1、4、5、6、7、8、9、22至26、32至35或42至49所列的氨基酸序列或其片段或变体，或基本上由所述氨基酸序列或其片段或变体组成，或由所述氨基酸序列或其片段或变体组成。在这点上，应注意，本文公开的所有突变蛋白均可n-或c-末端连接至亲和性标签，诸如五组氨酸标签、六组氨酸标签或(参阅seqidno：37至41，例如，其中六组氨酸标签融合于突变蛋白的c-末端)。因此，本申请还包括配备有此类标签的所有明确和一般描述的突变蛋白。如本发明中使用的术语“片段”在关于本发明的突变蛋白时涉及n-末端和/或c-末端缩短的，即缺乏至少一个n-末端和/或c-末端氨基酸的，衍生自全长成熟的人泪脂质运载蛋白的蛋白或肽。此类片段包含成熟的人泪脂质运载蛋白一级序列的优选地至少10、更优选地20、最优选地30或更多连续氨基酸，并且在成熟的人泪脂质运载蛋白的免疫测定中通常是可检测的。如本发明中使用的术语“变体”涉及包含氨基酸序列的修饰的蛋白或肽的衍生物，例如通过置换、缺失、插入或化学修饰。优选地，此类修饰不降低蛋白或肽的功能性。此类变体包括其中一个或多个氨基酸已被它们相应的d-立体异构体或被天然存在的20种氨基酸以外的氨基酸诸如，例如鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟赖氨酸、正缬氨酸置换的蛋白。但是，此类置换也可以是保守的，即氨基酸残基被化学上相似的氨基酸残基取代。保守置换的实例是下列组的成员之间的置换：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在本文中，值得注意的是，发现本发明的突变蛋白在约ph2.5至约ph9.5的大ph范围内，例如在约ph3.0至约ph9.2的ph范围内稳定。还包括在本发明的范围内的是以上突变蛋白，其潜在免疫原性方面已被改变。细胞毒性t细胞识别与i类主要组织相容性复合物(mhc)分子缔合的抗原呈递细胞的细胞表面上的肽抗原。肽与mhc分子结合的能力是等位基因特异性的，并且与它们的免疫原性相关。为了降低给定的蛋白的免疫原性，预测蛋白中的哪些肽具有与给定的mhc分子结合的潜能的能力具有重大价值。先前已描述了采用计算线程方法(computationalthreadingapproach)鉴定潜在t细胞表位的方法来预测给定的肽序列与mhci类分子的结合(altuvia等人(1995)j.mol.biol.249:244-250)。此类方法还可用于鉴定本发明的突变蛋白中的潜在t细胞表位和根据预定用途基于其预测的免疫原性选择特定的突变蛋白。还可以使已被预测含有t细胞表位的肽区域经受另外的诱变以减少或消除这些t细胞表位并由此使免疫原性最小化。从遗传工程抗体中除去两亲性表位已有描述(mateo等人(2000)hybridoma19(6):463-471)并可用于本发明的突变蛋白。由此获得的突变蛋白可拥有最低的免疫原性，这是它们用于治疗和诊断应用诸如下文描述的那些应用所需的。对于一些应用，采用本发明的突变蛋白的轭合形式也是有用的。因此，本发明还涉及轭合至轭合配偶体的脂质运载蛋白突变蛋白，所述轭合配偶体可选自由以下组成的组：酶标记物、着色的标记物、细胞抑制剂、可被光激活并适合用于光动力学疗法的标记物、半抗原、地高辛、生物素、化疗金属、或化疗金属和胶体金。突变蛋白还可轭合至有机药物分子。如本文所用的术语“有机分子”优选地指包含至少两个碳原子但优选地不超过7或12个可旋转的碳键，具有在100至2000道尔顿、优选地100至1000道尔顿范围的分子量，并任选地包括一个或两个金属原子的有机分子。一般而言，可以用任何适当的化学物质或酶标记本文所述的泪脂质运载蛋白突变蛋白，这直接或间接产生在化学、物理学、光学或酶促反应中可检测的化合物或信号。物理学反应并且同时是光学反应/标志物的实例是照射后的荧光发射。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶是酶标记物(并且同时是光学标记物)的实例，它们催化生色反应产物的形成。一般而言，通常用于抗体的所有标记物(除了专门用于免疫球蛋白的fc部分中的糖部分的那些)也可用于轭合至本发明的突变蛋白。本发明的突变蛋白还可与任何合适的治疗活性剂轭合，如用于此类剂向给定的细胞、组织或器官的靶向递送，或用于选择性靶向细胞如肿瘤细胞而不影响周围的正常细胞。此类治疗活性剂的实例包括放射性核素、毒素、小有机分子和治疗肽(诸如充当细胞表面受体的激动剂/拮抗剂的肽或竞争给定的细胞靶标上的蛋白结合位点的肽)。合适的毒素的实例包括但不限于百日咳毒素、白喉毒素、蓖麻毒蛋白、皂草素、假单胞菌外毒素、刺孢霉素或其衍生物、紫杉醇类化合物(taxoid)、美登木素类化合物(maytansinoid)、tubulysin或多拉司他汀类似物。多拉司他汀类似物可以是奥瑞司他汀(auristatin)e、单甲基奥瑞司他汀e、奥瑞司他汀pye和奥瑞司他汀phe。细胞抑制剂的实例包括但不限于顺铂、卡铂、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、紫杉特尔(多西他奇)、紫杉醇、蒽环类抗生素(多柔比星)、甲氨蝶呤、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、达卡巴嗪、环磷酰胺、依托泊苷、阿霉素、喜树碱、combretatastina-4相关化合物、磺胺类药物、噁二唑啉、苯并[b]噻吩、合成的螺酮缩醇吡喃、单四氢呋喃化合物、curacin和curacin衍生物、甲氧雌二醇衍生物和亚叶酸。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白还可与治疗活性的核酸诸如反义核酸分子、小干扰rna、微rna或核酶轭合。此类轭合物可通过本领域公知的方法产生。在一个实施方案中，本发明的突变蛋白还可偶联至靶向特定的身体区域的靶向部分，以将本发明的突变蛋白递送至身体内的期望区域或范围。其中可能需要此类修饰的一个实例是跨越血脑屏障。为了跨越血脑屏障，本发明的突变蛋白可偶联至促进跨越此屏障的主动转运的部分(参见gaillardpj等人,diphtheria-toxinreceptor-targetedbraindrugdelivery(靶向白喉毒素受体的脑部药物递送).internationalcongressseries.20051277；185-198或gaillardpj等人targeteddeliveryacrosstheblood-brainbarrier(跨越血脑屏障的靶向递送).expertopindrugdeliv.20052(2)：299-309。此类部分是例如以商标名2b-transtm(to-bbbtechnologiesbv,leiden,nl)可获得的。如上所述，在一些实施方案中，本发明的突变蛋白可轭合至延长所述突变蛋白的血清半衰期的部分(在这一点上，另参见国际专利申请pct/ep2007/057971或pct公布wo2006/56464，其中参考对ctla-4具有结合亲和性的人嗜中性白细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白的突变蛋白描述了此类轭合策略)。延长血清半衰期的部分可以是聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、脂肪酸分子诸如棕榈酸(vajo&duckworth2000,pharmacolrev.52,1-9)、免疫球蛋白的fc部分、免疫球蛋白的ch3结构域、免疫球蛋白的ch4结构域、白蛋白或其片段、白蛋白结合肽、白蛋白结合蛋白、igg-fc-结合蛋白或运铁蛋白，仅举几个例子。白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体、抗体片段包括结构域抗体(参见例如美国专利6,696,245)、对白蛋白具有结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白或另一蛋白或蛋白结构域。因此，用于延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的半衰期的合适的轭合配偶体包括白蛋白(osborn,b.l.等人(2002)pharmacokineticandpharmacodynamicstudiesofahumanserumalbumin-interferon-alphafusionproteinincynomolgusmonkeys(短尾猴中人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的药物代谢动力学和药效学研究)j.pharmacol.exp.ther.303,540-548)，或白蛋白结合蛋白，例如细菌白蛋白结合结构域，诸如链球菌蛋白g的白蛋白结合结构域(t.和skerra,a.(1998)useofanalbumin-bindingdomainfortheselectiveimmobilisationofrecombinantcaptureantibodyfragmentsonelisaplates(白蛋白结合结构域用于在elisa平板上选择性固定重组捕获抗体片段的用途).j.immunol.methods218,73-83)。可用作轭合配偶体的白蛋白结合肽的其他实例是，例如具有cys-xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-cys共有序列的那些，其中xaa1是asp、asn、ser、thr或trp；xaa2是asn、gln、his、ile、leu或lys；xaa3是ala、asp、phe、trp或tyr；和xaa4是asp、gly、leu、phe、ser或thr，如美国专利申请2003/0069395或dennis等人(dennis,m.s.,zhang,m.,meng,y.g.,kadkhodayan,m.,kirchhofer,d.,combs,d.&damico,l.a.(2002).“albuminbindingasageneralstrategyforimprovingthepharmacokineticsofproteins(白蛋白结合作为改善蛋白的药物代谢动力学的通用策略).”jbiolchem277,35035-35043)所述。在其他实施方案中，白蛋白自身或白蛋白的生物活性片段可用作本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的轭合配偶体。术语“白蛋白”包括所有哺乳动物白蛋白，诸如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。白蛋白或其片段可重组产生，如美国专利5,728,553或欧洲专利申请ep0330451和ep0361991所述。重组人白蛋白novozymesdeltaltd.(nottingham,uk)可轭合或融合至脂质运载蛋白突变蛋白以延长所述突变蛋白的半衰期。如果白蛋白结合蛋白是抗体片段，其可以是结构域抗体。结构域抗体(dab)被加工为允许精确地控制生物物理性质和体内半衰期，以产生最优的安全性和有效的产物谱。结构域抗体是例如从domantisltd.(cambridge,uk和ma,usa)商业可获得的。使用运铁蛋白作为延长本发明突变蛋白的血清半衰期的部分，所述突变蛋白可遗传融合于非糖基化的运铁蛋白的n或c末端或两个末端。非糖基化的运铁蛋白具有14-17天的半衰期，并且运铁蛋白融合蛋白将相似地具有延长的半衰期。运铁蛋白载体还提供高生物利用度、生物分布和循环稳定性。此技术是从biorexis(biorexispharmaceuticalcorporation,pa,usa)商业可获得的。用作蛋白稳定剂/半衰期延长配偶体的重组人运铁蛋白(deltaferrintm)也是从novozymesdeltaltd.(nottingham,uk)商业可获得的。如果免疫球蛋白的fc部分被用于延长本发明的突变蛋白的血清半衰期目的，可使用从syntonixpharmaceuticals,inc(ma,usa)商业可获得的synfusiontm技术。使用此fc-融合技术允许产生作用更长的生物药物，并可例如由连接至抗体的fc区的两个拷贝的突变蛋白组成，以改善药物代谢动力学、溶解性和生产效率。延长本发明的突变蛋白的半衰期的又一可选方案是将本发明的突变蛋白的n-或c-末端融合于长的、无组织的、灵活的富含甘氨酸的序列(例如具有约20至80个连续甘氨酸残基的聚甘氨酸)。在wo2007/038619中公开的此方法，例如，也可以是术语“rpeg”(重组peg)。如果使用聚亚烷基二醇作为轭合配偶体，则该聚亚烷基二醇可以是取代的、未取代的、线性的或分支的。其还可以是活化的聚亚烷基衍生物。合适的化合物的实例是聚乙二醇(peg)分子，如关于干扰素的wo99/64016、美国专利6,177,074或美国专利6,403,564中所述，或如为其他蛋白诸如peg修饰的天冬酰胺酶、peg-腺苷脱氨酶(peg-ada)或peg-超氧化物歧化酶所述(参见例如，fuertges等人(1990)theclinicalefficacyofpoly(ethyleneglycol)-modifiedproteins(聚乙二醇修饰的蛋白的临床效力)j.control.release11,139-148)。此类聚合物优选地为聚乙二醇的分子量可在约300至约70.000道尔顿范围内，包括，例如分子量为约10.000、为约20.000、为约30.000或为约40.000道尔顿的聚乙二醇。此外，如例如美国专利6,500,930或6,620,413中所述，糖类寡聚物和聚合物诸如淀粉或羟乙基淀粉(hes)可轭合至本发明的突变蛋白以用于延长血清半衰期目的。如果上述部分之一轭合至本发明的人泪脂质运载蛋白突变蛋白，那么轭合至氨基酸侧链可以是有利的。合适的氨基酸侧链可天然存在于人泪脂质运载蛋白的氨基酸序列中，或可通过诱变引入。在合适的结合位点是经由诱变引入的情况下，一种可能是用半胱氨酸残基置换所述适当的位置处的氨基酸。在一个实施方案中，此类突变包括以下置换中的至少一个：thr40→cys、glu73→cys、arg90→cys、asp95→cys、lys121→cys、asn123→cys或glu131→cys。在这些位置中的任何位置处新产生的半胱氨酸残基可接着用于将所述突变蛋白轭合至延长所述突变蛋白的血清半衰期的部分，诸如peg或其活化衍生物。在另一实施方案中，为了提供用于将上述部分之一轭合至本发明的突变蛋白的合适的氨基酸侧链，可通过诱变引入人工氨基酸。一般而言，此类人工氨基酸被设计为反应性更强，并由此促进与所需的部分的轭合。可经由人工trna引入的此类人工氨基酸的一个实例是对乙酰苯丙氨酸。对于本文公开的突变蛋白的几种应用，使用其融合蛋白形式可能是有利的。在一些实施方案中，本发明的人泪脂质运载蛋白突变蛋白在其n-末端或其c-末端融合于蛋白、蛋白结构域或肽，诸如信号序列和/或亲和性标签。对于药物应用，本发明的突变蛋白可融合于延长突变蛋白的体内血清半衰期的融合配偶体(同样参见pct公布wo2006/56464，其中参考对ctla-4具有结合亲和性的人嗜中性白细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白的突变蛋白描述了合适的融合配偶体)。与上文描述的轭合物相似，融合配偶体可以是免疫球蛋白的fc部分、免疫球蛋白的ch3结构域、免疫球蛋白的ch4结构域、白蛋白、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白，仅举几个例子。同样，白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白或对白蛋白具有结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白。因此，用于延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的半衰期的合适的融合配偶体包括白蛋白(osborn,b.l.等人(2002)同上j.pharmacol.exp.ther.303,540-548)，或白蛋白结合蛋白，例如细菌白蛋白结合结构域，诸如链球菌蛋白g的白蛋白结合结构域(t.和skerra,a.(1998)同上j.immunol.methods218,73-83)。dennis等人，同上(2002)或美国专利申请2003/0069395中描述的具有cys-xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-cys共有序列，其中xaa1是asp、asn、ser、thr或trp；xaa2是asn、gln、his、ile、leu或lys；xaa3是ala、asp、phe、trp或tyr；和xaa4是asp、gly、leu、phe、ser或thr的白蛋白结合肽也可用作融合配偶体。还可以使用白蛋白自身或白蛋白的生物活性片段作为本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的融合配偶体。术语“白蛋白”包括所有哺乳动物白蛋白，诸如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。白蛋白或其片段的重组产生是本领域公知的，并且例如描述于美国专利5,728,553、欧洲专利申请ep0330451或ep0361991。融合配偶体可赋予本发明的脂质运载蛋白突变蛋白新的特性，诸如对其他分子的酶促活性或结合亲和性。合适的融合蛋白的实例是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、谷胱甘肽(gluthation)-s-转移酶、蛋白g的白蛋白结合结构域、蛋白a、抗体片段、寡聚化结构域、具有相同或不同结合特异性(其造成“duocalins”的形成，参阅schlehuber,s.和skerra,a.(2001),duocalins,engineeredligand-bindingproteinswithdualspecificityderivedfromthelipocalinfold(duocalins，衍生自脂质运载蛋白折叠的具有双重特异性的工程设计的配体结合蛋白).biol.chem.382,1335-1342)的脂质运载蛋白突变蛋白或毒素。特别地，可以将本发明的脂质运载蛋白突变蛋白与单独的酶活性位点融合，以使得到的融合蛋白的两个“组分”一起作用于给定的治疗靶标。脂质运载蛋白突变蛋白的结合结构域连接于造成疾病的靶标，允许酶结构域消除所述靶标的生物功能。亲和性标签诸如或ii(schmidt,t.g.m.等人(1996)j.mol.biol.255,753-766)、myc-标签、flag-标签、his6-标签或ha-标签或蛋白诸如谷胱甘肽-s-转移酶也允许容易地检测和/或纯化重组蛋白，是优选的融合配偶体的进一步实例。最后，具有生色或荧光性质的蛋白诸如绿色荧光蛋白(gfp)或黄色荧光蛋白(yfp)也是用于本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的合适的融合配偶体。如本文所用的术语“融合蛋白”还包括含有信号序列的根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白。在多肽的n-末端的信号序列指导此多肽至特定的细胞区室，例如大肠杆菌的周质或真核细胞的内质网。许多信号序列是本领域已知的。用于将多肽分泌到大肠杆菌的周质的优选信号序列是ompa-信号序列。本发明还涉及包含编码如本文所述的突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子(dna和rna)。由于遗传密码的简并性允许某些密码子被指定相同氨基酸的其他密码子置换，因此本发明并不限于编码本发明的突变蛋白的特定核酸分子，而是包括包含编码功能突变蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。因此，本发明还包括编码根据本发明的突变蛋白的核酸序列，所述突变蛋白包含天然成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任何位置的至少一种密码子处的突变，其中编码成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置61和153处的半胱氨酸残基的至少一个的密码子已被突变为编码任何其他氨基酸残基。本文公开的发明还包括编码泪脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子，其包含指明的实验诱变序列位置之外的其他突变。此类突变通常是耐受的，或者甚至可证明是有利的，例如如果它们有助于突变蛋白的改善的折叠效率、血清稳定性、热稳定性或配体结合亲和性。本申请中公开的核酸分子可被“可操作地连接”于调节序列(或多个调节序列)以允许此核酸分子的表达。如果核酸分子包含含有关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件并且此类序列“可操作地连接”于编码多肽的核苷酸序列，则称该核酸分子诸如dna，“能够表达核酸分子”或能够“允许核苷酸序列的表达”。可操作连接是其中调节序列元件和要表达的序列以允许基因表达的方式连接的连接。基因表达必需的调节区域的精确性质可随物种而不同，但是一般而言，这些区域包含启动子，在原核生物中，启动子既含有启动子本身，即指导转录起始的dna元件，又含有在被转录成rna时将发出翻译起始信号的dna元件。此类启动子区域通常包括参与转录和翻译起始的5'非编码序列，诸如原核生物中的-35/-10盒和shine-dalgarno元件或真核生物中的tata盒、caat序列和5'-加帽元件。这些区域还可包括增强子或抑制子元件以及翻译信号和用于将天然多肽靶向至宿主细胞的特定区室的先导序列。此外，3'非编码序列可含有参与转录终止、聚腺苷酸化或类似事件的调节元件。但是，如果这些终止序列在特定的宿主细胞中没有令人满意的功能，则可将它们置换为在所述细胞中具有功能的信号。因此，本发明的核酸分子可包括调节序列，优选地启动子序列。在另一优选的实施方案中，本发明的核酸分子包含启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子是，例如tet启动子、lacuv5启动子或t7启动子。可用于真核细胞中的表达的启动子的实例是sv40启动子或cmv启动子。本发明的核酸分子还可以是载体或任何其他类型的克隆媒介物(vehicle)诸如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体的部分。在一个实施方案中，所述核酸分子包含在噬粒中。噬粒载体指编码温和噬菌体诸如m13或f1的基因间区域或融合于感兴趣的cdna的其功能部分的载体。用此类噬菌粒载体和适当的辅助噬菌体(如m13k07、vcs-m13或r408)重复感染细菌宿主细胞之后，产生完整的噬菌体颗粒，由此实现编码的异源cdna与噬菌体表面上展示的其相应多肽的物理偶联(综述参见，如kay,b.k.等人(1996)phagedisplayofpeptidesandproteins-alaboratorymanual(肽和蛋白的噬菌体展示实验手册),第1版,academicpress,newyorkny；lowman,h.b.(1997)annu,rev.biophys,biomol.struct.26,401-424,或rodi,d.j.和makowski,l.(1999)curr.opin.biotechnol.10,87-93)。除了上文描述的调节序列和编码本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸序列之外，此类克隆媒介物可包括衍生自与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列，以及赋予转化的或转染的细胞可选择的表型的选择标志物。许多合适的克隆载体是本领域已知的，并且是商业可获得的。编码本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的dna分子并且特别是含有此类脂质运载蛋白突变蛋白的编码序列的克隆载体可被转化到能够表达该基因的宿主细胞中。转化可使用标准技术进行(sambrook,j.等人(1989)，同上)。因此，本发明还涉及含有本文公开的核酸分子的宿主细胞。转化的宿主细胞在适于表达编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列的条件下培养。合适的宿主细胞可以是原核的，诸如大肠埃希氏菌(escherichiacoli)(大肠杆菌)或枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，或真核的，诸如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、sf9或high5昆虫细胞、永生化哺乳动物细胞系(如hela细胞或cho细胞)或原代哺乳动物细胞。本发明还涉及产生本发明的突变蛋白的方法，其中所述突变蛋白、所述突变蛋白的片段或所述突变蛋白和另一多肽的融合蛋白是通过遗传工程方法以编码所述突变蛋白的核酸为起点产生的。所述方法可在体内进行，所述突变蛋白可例如在细菌或真核宿主生物体中产生，然后从此宿主生物体或其培养物中分离。还可以体外产生蛋白，例如通过使用体外翻译系统。当在体内产生所述突变蛋白时，通过重组dna技术将编码本发明的突变蛋白的核酸引入合适的细菌或真核宿主生物体(如上文已经列举的)。为此目的，首先使用公认的标准方法(sambrook,j.等人(1989)，同上)用包含编码本发明的突变蛋白的核酸分子的克隆载体转化宿主细胞。然后在允许异源dna表达并由此合成相应多肽的条件下培养宿主细胞。随后，从细胞或从培养基中回收多肽。在本发明的一些泪脂质运载蛋白突变蛋白中，cys61和cys153之间天然存在的二硫键被除去。因此，此类突变蛋白(或不包含分子内二硫键的任何其他泪脂质运载蛋白突变蛋白)可在具有还原性氧化还原环境的细胞区室中产生，例如，在革兰氏阴性细菌的细胞质中。在本发明的脂质运载蛋白突变蛋白包含分子内二硫键的情况下，可能优选使用适当的信号序列将新生多肽引导至具有氧化性氧化还原环境的细胞区室中。此类氧化性环境可由革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌的周质、在革兰氏阳性细菌的胞外环境中或在真核细胞的内质网腔中提供，并且通常有利于结构性二硫键的形成。但是，也可以在宿主细胞优选地大肠杆菌的胞质溶胶中产生本发明的突变蛋白。在这种情况下，多肽可以可溶和折叠的状态直接获得，或可以包含体的形式回收，然后进行体外复性。进一步的选择是使用具有氧化性胞内环境的特定宿主菌株，其可因此允许在胞质溶胶中形成二硫键(venturim,seifertc,huntec.(2002)“highlevelproductionoffunctionalantibodyfabfragmentsinanoxidizingbacterialcytoplasm(氧化性细菌细胞质中功能性抗体fab片段的高水平产生).”j.mol.biol.315,1-8.)。然而，本发明的突变蛋白可不必通过仅使用遗传工程产生或生产。相反，脂质运载蛋白突变蛋白还可通过化学合成诸如merrifield固相多肽合成或通过体外转录和翻译获得。例如，可以使用分子建模鉴定有希望的突变，然后体外合成想要的(设计的)多肽并研究对给定的靶标的结合活性。用于蛋白的固相和/或溶液相合成的方法是本领域公知的(综述参见，如lloyd-williams,p.等人(1997)chemicalapproachestothesynthesisofpeptidesandproteins(合成肽和蛋白的化学方法).crcpress,bocaraton,fields,g.b.和colowick,s.p.(1997)solid-phasepeptidesynthesis(固相肽合成).academicpress,sandiego,或bruckdorfer,t.等人(2004)curr.pharm.biotechnol.5,29-43)。在另一实施方案中，本发明的突变蛋白可采用本领域技术人员已知的公认方法通过体外转录/翻译产生。本发明还涉及包含至少一种本发明的人泪脂质运载蛋白的突变蛋白或其融合蛋白或轭合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可经由对蛋白药物在治疗上有效的任何肠胃外或非肠胃外(肠内)路径施用。肠胃外应用方法包括，例如皮内、皮下、肌肉内、气管内、鼻内、玻璃体内或静脉内注射和输注技术，如以注射溶液、输注溶液或酊剂的形式，以及气溶胶滴注(installation)和吸入，如以气溶胶混合物、喷雾或粉剂的形式。关于肺部药物递送，即经由气溶胶吸入(其还可用于鼻内施用)或气管内滴注(instiallation)，的综述由例如j.s.patton等人thelungsasaportalofentryforsystemicdrugdelivery(肺作为全身药物递送的进入入口).proc.amer.thoracicsoc.2004vol.1第338-344页)给出。非肠胃外递送模式是，例如，口服，如以丸剂、片剂、胶囊剂、溶液剂或混悬剂的形式，或直肠递送，如以栓剂的形式。本发明的突变蛋白可根据需要在含有常规的无毒的药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和媒介物的制剂中全身或局部施用。在本发明的一个实施方案中，药物被肠胃外施用于哺乳动物，特别是人。相应的施用方法包括但不限于，例如皮内、皮下、肌肉内、气管内或静脉内注射和输注技术，如以注射溶液、输注溶液或酊剂的形式，以及气溶胶滴注和吸入，如以气溶胶混合物、喷雾或粉剂的形式。在化合物具有相对短的血清半衰期的情况下，静脉内和皮下输注和/或注射的组合可能是最方便的。药物组合物可以是水溶液、水包油乳液或油包水乳液。在这一点上，值得注意的是，还可以使用透皮递送技术，如离子电渗疗法、超声促渗或微针增强的递送，如meidanvm和michniakbb2004am.j.ther.11(4):312-316中所述，进行本文描述的突变蛋白的透皮递送。非肠胃外递送模式是，例如，口服，如以丸剂、片剂、胶囊剂、溶液剂或混悬剂的形式，或直肠施用，如以栓剂的形式。本发明的突变蛋白可在含有多种常规的无毒的药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和媒介物的制剂中全身或局部施用。应用的突变蛋白的剂量可在宽的限制内变化以实现期望的预防效应或治疗应答。它将，例如，取决于化合物对所选的配体的亲和性以及突变蛋白和所述配体的复合物在体内的半衰期。此外，最优的剂量将取决于突变蛋白或其融合蛋白或其轭合物的生物分布、施用模式、所治疗的疾病/疾患的严重度以及患者的医疗状况。例如，当在用于局部应用的软膏剂中使用时，可使用高浓度的泪脂质运载蛋白突变蛋白。但是，如果需要，突变蛋白还可以持续释放制剂给出，例如脂质体分散物或基于水凝胶的聚合物微球，像polyactivetm或octodextm(参阅bos等人,businessbriefing:pharmatech2003:1-6)。可获得的其他持续释放制剂有例如基于plga的聚合物(prpharmaceuticals)、基于pla-peg的水凝胶(medincell)和基于pea的聚合物(medivas)。因此，可使用药学上可接受的成分以及公认的制备方法将本发明的突变蛋白配制成组合物(gennaro,a.l.和gennaro,a.r.(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy(雷明顿：药物科学与实践),第20版.,lippincottwilliams&wilkins,philadelphia,pa)。为了制备药物组合物，可使用药学上惰性的无机或有机赋形剂。为了制备如丸剂、粉剂、明胶胶囊剂或栓剂，可以使用例如，乳糖、滑石、硬脂酸和其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然和硬化的油。用于生产溶液剂、混悬剂、乳液、气溶胶混合物或在使用前重构成溶液剂或气溶胶混合物的粉剂的合适的赋形剂包括水、醇类、甘油、多元醇和其合适的混合物以及植物油。药物组合物还可含有添加剂，诸如，例如填充剂、粘合剂、湿润剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，以及另外，溶剂或助溶剂或实现贮藏效应的剂。后者是可将融合蛋白掺入缓释或持续释放或靶向递送系统，诸如脂质体和微胶囊。制剂可通过许多手段灭菌，包括滤过阻留细菌的过滤器或通过在无菌固体组合物的形式中掺入灭菌剂，所述无菌固体组合物可在临用前溶解或分散于无菌水或其他无菌介质中。本发明的另一方面涉及治疗有相应需要的受治疗者中的疾病或疾患的方法。此疾病可牵涉或可不牵涉c-met受体酪氨酸激酶的结合/相互作用。所述疾病可以是其发展牵涉hgf/c-met途径的疾病。此类疾病或疾患可以是细胞增殖性疾患。细胞增殖性疾病的实例是癌症。治疗的癌症的实例包括但不限于，例如肝癌、结肠癌(例如，原发性结肠癌，参见例如clincancerres.2003,9(4),第1480-1488页)、结肠直肠癌(参阅zeng等人,clin.exp.metastasis,200004,21(5),第409-417页)、肝细胞癌、乳头状肾癌、头颈鳞状细胞癌(hnsc)、头颈鳞癌的淋巴结转移瘤(参见，例如schiering等人,pnas,vol.100,no.22,第12654-12559页,2003或综述trusolino&comoglio,(2002),nat.rev.cancer,289-300或maulik等人(2002)cytokinegrowthfaktorrev.13,41-59)。对于此类治疗目的，可使用拮抗hgf/c-met途径的泪脂质运载蛋白突变蛋白、和/或泪脂质运载蛋白突变蛋白的毒素融合体或轭合物、或泪脂质运载蛋白突变蛋白与上文所述的细胞抑制剂的轭合物。需要此类治疗的受治疗者可以是哺乳动物，诸如人、狗、小鼠、大鼠、猪、猿诸如短尾猴，仅举几个例证性实例。如从以上的公开内容中明显的，本发明的突变蛋白或其融合蛋白或轭合物可用于许多应用。一般而言，此类突变蛋白可用于所有使用抗体的应用，特异地依赖fc部分的糖基化的那些应用除外。因此，在本发明的另一方面，本发明的人泪脂质运载蛋白的突变蛋白可用于体外检测给定的配体，即c-met受体或其结构域或片段。此类用途可包括以下步骤：使突变蛋白与怀疑含有给定的配体的样品在合适的条件下接触，从而允许在所述突变蛋白和所述给定的配体之间形成复合物，并通过合适的信号检测复合的突变蛋白。可检测的信号可由标记物引起，如以上解释的，或由结合即复合物形成本身造成的物理性质的变化引起。一个实例是表面等离子体共振，其值在结合配偶体的结合过程中被改变，所述结合配偶体之一固定在表面诸如金箔上。本文公开的人泪脂质运载蛋白的突变蛋白还可用于体外分离人泪脂质运载蛋白的给定的配体。此类用途可包括以下步骤：使所述突变蛋白与猜测含有所述配体的样品在合适的条件下接触，从而允许在所述突变蛋白和所述给定的配体之间形成复合物，并从样品中分离突变蛋白/配体复合物。在突变蛋白用于检测给定的配体以及分离给定的配体的两种用途中，突变蛋白和/或靶标可固定在合适的固相上。本发明的人泪脂质运载蛋白突变蛋白还可用于将化合物靶向至预先选择的位点。在一个此类实施方案中，人泪脂质运载蛋白的突变蛋白用于将药学活性化合物靶向至生物体或组织中预先选择的位点，包括：a)使所述突变蛋白与所述化合物轭合，和b)将突变蛋白/化合物复合物递送至预先选择的位点。所述药学活性化合物可选自由以下组成的组：毒素、细胞抑制剂或c-met拮抗剂。c-met拮抗剂的实例包括单克隆抗体(其通常结合c-met的胞外结构域)或靶向胞内结构域(特别是酪氨酸激酶结构域)的抑制剂。小分子抑制剂的实例包括但不限于，wo2004/031184中所述的1,3,5,三嗪-2,4-二胺衍生物、2-(2-,6-二氯苯基-咪唑衍生物、含氮的双环衍生物、5-苄基磺酰基和磺胺取代的吡咯二氢吲哚(例如，由sugen开发的并由christensonj.g.aacr,abst4963和6200,2003或sattlerm等人,aacr,abst1005,2003描述的化合物pha-665752)。对于此类目的，使突变蛋白与c-met受体酪氨酸激酶或结构域接触以允许形成复合物。然后将包含突变蛋白和感兴趣的化合物的复合物递送至预先选择的位点。此用途特别适合于，但不限于将药物(选择性地)递送至生物体中预先选择的位点，诸如猜测要用所述药物治疗的感染的身体部位、组织或器官。除了在突变蛋白和感兴趣的化合物之间形成复合物之外，还可使突变蛋白与给定的化合物反应，以产生突变蛋白和化合物的轭合物。与上述复合物相似，此类轭合物可适于将所述化合物递送至预先选择的靶位点。突变蛋白和化合物的此类轭合物还可包括将突变蛋白和化合物共价连接至彼此的连接体。任选地，此类连接体在血流中是稳定的，但在细胞环境中是可切割的。本文公开的突变蛋白和其衍生物因此可用于与抗体或其片段相似的许多领域。除了将给定的突变蛋白结合于支持物，以允许固定或分离该突变蛋白的靶标或此靶标的轭合物或融合蛋白的用途之外，所述突变蛋白还可用于使用酶、抗体、放射活性物质或具有生物化学活性或指定的结合特性的任何其他基团进行标记。通过这样做，可检测它们的相应靶标或其轭合物或融合蛋白，或使之与它们接触。例如，本发明的突变蛋白可用于通过公认的分析方法(如elisa或蛋白质印迹)或通过显微术或免疫传感术(immunosensorics)检测化学结构。在这里，检测信号可以是通过使用合适的突变蛋白轭合物或融合蛋白直接产生的，或是通过经由抗体免疫化学检测结合的突变蛋白间接产生。药学中还存在本发明的突变蛋白的许多可能应用。除了它们用于体外诊断和药物递送的用途之外，还可产生结合，例如组织或肿瘤特异性细胞表面分子的本发明的突变体多肽。本发明通过下列非限制性实施例和附图得到进一步例证，其中：图1显示噬粒载体ptlpc59的图谱，图1a显示载体的调节元件的示意性图示，图1b代表用于表达天然文库的泪脂质运载蛋白突变蛋白的基因构建体的示意性放大，图2显示表达载体ptlpc10的图谱，图3显示与野生型泪脂质运载蛋白的多肽序列比对的泪脂质运载蛋白突变蛋白s225.4-k24的多肽序列(seqidno：1)，图4显示经由elisa的亲和性筛选方法和获得的突变蛋白对c-met的亲和性的结果，图5显示泪脂质运载蛋白突变蛋白s225.4-k24(seqidno：1)和s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07(seqidno：4-9)的多肽序列的比对，图6显示本发明的人泪脂质运载蛋白突变蛋白(s244.2-h08；seqidno:4)与c-met的结合的biacore测量结果，图7显示在ht-29细胞的细胞环境中对c-met结合突变蛋白s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07(seqidno：4-9)的亲和性评估的结果，图8显示经由elisa的亲和性筛选方法和获得的突变蛋白对c-met的亲和性的结果，图9显示泪脂质运载蛋白突变蛋白s225.4-k24(seqidno：1)、s244.2-h08(seqidno：4)、s261.1-l12、s261.1-j01和s261.1-l17(seqidno：32-34)的多肽序列的比对。图10显示表达载体ptlpc47的图谱，图11显示在ht-29细胞的细胞环境中对c-met结合突变蛋白s261.1-l12、s261.1-j01和s261.1-l17(seqidno:32-34)的亲和性评估的结果，图12显示本发明的人泪脂质运载蛋白突变蛋白(s261.1-l17；seqidno:34)对c-met的结合的竞争elisa测量结果，图13显示在ht-29细胞的细胞环境中对c-met结合突变蛋白s261.1-l12_c123(seqidno:35)的亲和性评估的结果，图14显示对泪脂质运载蛋白突变蛋白s261.1-j01(seqidno：33)的ph稳定性测试的结果，图15显示本发明的另外的泪脂质运载蛋白突变蛋白(其中已引入了另外的单一突变)的多肽序列的比对以及它们与c-met结合的kd值，图16显示在ht-29细胞的细胞环境中对c-met结合突变蛋白s318.1-c10、s318.1-l13、s318.1-a16、s318.2-i24和s318.1-o12(seqidno：42、44、45、46和49)的亲和性评估的结果。实施例除非另外指明，否则使用重组基因技术的公认方法，例如，如sambrook等人(同上)中所述。实施例1：具有1,6x1010个独立tlc突变蛋白的文库的产生具有高复杂性的泪脂质运载蛋白(tlc)的随机文库基本按pct申请pct/ep2007/057971的实施例1中的描述制备，其公开内容通过引用完全并入本文，例外是噬菌体展示ptlpc59的文库基因构建体(图1a和1b)被置于lacp/o而不是tetp/o控制之下并遗传融合于vcsm13噬菌体的全长基因iii。使用用于大肠杆菌感染的m13k07hyperphage(progen)在文献中描述的标准方法下实现了多价噬菌体展示形式的泪脂质运载蛋白突变蛋白噬菌体产生(m.kirsch等人/journalofimmunologicalmethods301(2005)173-185)。实施例2：对c-met受体具有亲和性的tlc突变蛋白的噬菌粒展示和选择噬菌粒展示和选择采用实施例1中获得的噬菌粒基本上按wo2005/019256实施例3中所述进行，具有以下修改：靶蛋白(c-met受体-fc,r&dsystems)以200nm的浓度使用，并且作为fc-融合蛋白呈递于文库，随后使用蛋白g珠(dynal)捕获噬菌体-靶标复合物。为了选择非拮抗地作用于天然配体hgf的结合子(binder)，在c-met结合的文库噬菌体于碱性条件下洗脱之前，引入了使用200nm可溶hgf(r&dsystems)的另外的洗涤步骤。进行了四轮选择。实施例3：使用高通量elisa筛选的c-met受体特异性突变蛋白的鉴定根据实施例2选择的突变蛋白的筛选基本上按wo2006/56464实施例3中的描述进行。对实验方案的修改描述如下：表达载体为ptlpc10(图2)。使用的靶蛋白为1μg/ml的c-met受体-fc(r&dsystems)，3％牛奶代替人血清白蛋白用作无关的对照靶标。按实施例2中的描述选择的2880个克隆的筛选导致鉴定342个主要匹配克隆(hits)，表明从文库中成功分离了突变蛋白。使用此方法鉴定了克隆s225.4-k24(seqidno：1)。s225.4-k24的序列还描绘于图3。实施例4：使用易错pcr的突变蛋白s225.4-k24的亲和性成熟基于突变蛋白s225.4-k24(seqidno：1)的变体的文库的产生基本上按照wo2006/56464实施例5中的描述进行，使用寡核苷酸tl50bio：tatctgaaggccatgacggtggac(seqidno：2)和tl51bio：tgcccacgagccacacccctggga(seqidno：3)，得到平均每个结构基因具有5个置换的文库。噬菌粒选择按实施例2中的描述进行，但是采用限制的c-met受体-fc的靶标浓度(2nm、0.5nm和0.1nm)，并经由固定在聚苯乙烯平板上的抗-人igg-fc特异性mab捕获靶标和噬菌粒复合物。在相同的条件下但以组合的靶标限制(1nm)和短孵育时间(5分钟)或靶标限制(5nm、0.5nm和0.1nm)与噬菌粒在ph3、60℃下孵育15分钟或ph10、rt孵育30分钟的组合进行另外的选择。进行了四轮选择。实施例5：使用高通量elisa筛选的c-met受体结合突变蛋白的亲和性筛选按实施例3中的描述进行筛选，但进行以下修改：使用浓度为2.5μg/ml或0.6μg/ml的c-met受体-fc(r&dsystems)。总共筛选了2880个克隆，得到1510个匹配克隆，表明从文库中成功地富集了成熟的突变蛋白。另外，在可选的筛选设置中，聚苯乙烯平板上包被了单克隆抗-t7抗体，并在与限制浓度的c-met受体-fc(60nm、15nm和2.5nm)孵育之前，经由t7-标签捕获了表达的突变蛋白。使用针对人igg-fc结构域的hrp-轭合的多克隆抗体检测c-met受体-fc的结合。此类筛选的结果描绘于图4。按实施例4和5中的描述选择的大量突变蛋白被鉴定为与充当亲和性成熟的基础的突变蛋白s225.4-k24(seqidno：1)相比具有改善的对c-met受体的亲和性。使用此方法，鉴定了突变蛋白s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07(seqidno：4-9)。s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07的序列也描绘于图5。实施例6：c-met受体结合突变蛋白的生产对于c-met受体特异性突变蛋白的制备性生产，含有在表达载体ptlpc10上编码的相应突变蛋白(图2)的大肠杆菌k12菌株jm83在2l摇瓶培养中于lb-氨苄青霉素培养基中根据schlehuber,s.等人(jmol.biol.(2000),297,1105-1120)中描述的实验方案培养。当需要更大量的蛋白时，使用含有相应表达载体的大肠杆菌菌株w3110，基于schiweck,w.和skerra,a,proteins(1995)23,561-565)中描述的实验方案，进行经由11或101容器中的台式发酵罐培养的周质产生。根据由skerra,a.&schmidt,t.g.m.(2000)(useofthestrep-tagandstreptavidinfordetectionandpurificationofrecombinantproteins(strep-标签和链霉亲和素用于检测和纯化重组蛋白的用途).methodsenzymol.326a,271-304)描述的程序，在单一步骤中经由使用适当的床体积的柱的链霉亲和素亲和层析从周质级分中纯化突变蛋白。为了得到更高的纯度并除去任何聚集的重组蛋白，最后在pbs缓冲液存在下在superdex75hr10/30柱(24-ml床体积,amershampharmaciabiotech)上进行突变蛋白的凝胶过滤。汇集单体蛋白级分，通过sds-page检查纯度并用于进一步的生化表征。实施例7：使用表面等离子体共振光谱(spr)的亲和性测量亲和性测量基本上按wo2006/56464实施例9中描述的进行，但有以下修改：将大约9000ru的c-met受体-fc(r&dsystems)直接固定在cm5芯片(而不是wo2006/56464中使用2000ru的人ctla-4或鼠ctla-4-fc作为靶标)的表面上，并注射80μl浓度为0.2-0.5μm的突变蛋白(而不是wo2006/56464中使用的40μl样品纯化的浓度为5-0.3μm的脂质运载蛋白突变蛋白)。测量之间，通过注射5-10μl的50mmnaohph10、2.5mnacl再生芯片表面。流速保持恒定在10μl/min。采用s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07的亲和性测量的结果概括于表i，s244.2-h08的示例性感应图(sensorgram)的评估描绘于图6。表i.通过spr确定的本发明的选择的突变蛋白对c-met受体的亲和性。平均值是从至少3次独立测量结果计算的。实施例8：通过流式细胞术在完整的细胞上对脂质运载蛋白突变蛋白进行亲和性评级在显示hgfr/c-met内源表达的ht-29细胞(atcc)上滴定脂质运载蛋白突变蛋白。在30μl的总体积中从10μm浓度开始以24个1:2稀释测试脂质运载蛋白突变蛋白。对于每个结合反应，将100,000个细胞在含有2％胎牛血清(fcs)的pbs中在4℃下孵育2h。用pbs、2％fcs洗涤细胞两次，并与每个反应375ng生物素化的、亲和纯化的山羊抗泪脂质运载蛋白抗血清孵育30分钟。洗涤后，检测在与链霉亲和素-藻红蛋白孵育另外30分钟后实现。洗涤细胞，并在facscalibur流式细胞仪上分析荧光。将平均荧光强度(mfi)针对脂质运载蛋白突变蛋白的浓度作图，并拟合为s形剂量响应曲线，使用graphpadprism软件确定ec50值。从中确定s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07的ec50值的滴定曲线描绘于图7，计算的ec50值概括于表ii。克隆ec50[nm]stds244.2-h0813,21,3s244.2-l0116,81,7s244.4-n0518,218,2s244.8-i0744,85,9s244.8-i2028,14s244.8-j0537,85,5表ii.通过在ht-29细胞上的facs滴定确定的本发明的选择的突变蛋白对c-met受体的ec50值和标准偏差。实施例9：脂质运载蛋白突变蛋白-cys变体的筛选为了提供用于与如活化的peg或药学上相关的标记物位点定向偶联的反应基团，通过位点定向诱变引入了未配对的半胱氨酸残基。然后按实施例6中的描述在大肠杆菌中产生携带游离cys残基的重组突变蛋白，确定表达产量，并基本按实施例7中描述的通过spr测量亲和性。逐对采用以下寡核苷酸，分别引入替代氨基酸thr40、asp95、arg90、lys121、asn123或val93的半胱氨酸：h08_t40c正向cgtctcggtaacacccatatgcctcacgaccctggaaggg(seqidno：10)和h08t40c反向cccttccagggtcgtgaggcatatgggtgttaccgagacg(seqidno：11)，或h08_d95c正向caggtcgcacgtgaagtgccactacatcttttactctgaggg(seqidno：12)和h08_d95c反向ccctcagagtaaaagatgtagtggcacttcacgtgcgacctg(seqidno：13)，或h08_r90c正向cgtggcatacatcagctgctcgcacgtgaaggatcac(seqidno：14)和h08_r90cgtgatccttcacgtgcgagcagctgatgtatgccacg(seqidno)：15，或a22_k121c正向ggcagagacccctgcaacaacctggaagccttg(seqidno：16)和a22_k121c反向caaggcttccaggttgttgcaggggtctctgcc(seqidno：17)，或a22_n123c正向ggcagagaccccaagaactgcctggaagccttggag(seqidno：18)和a22_n123c正向ggcagagaccccaagaactgcctggaagccttggag(seqidno：19)，或h08_v93c正向catcagcaggtcgcactgcaaggatcactacatcttttac(seqidno：20)和h08_v93c反向gtaaaagatgtagtgatccttgcagtgcgacctgctgatg(seqidno：21)。c-met受体-特异性突变蛋白s244.2-h08(seqidno：4)的cys-筛选的示例性结果在下面的表iii中给出。克隆产量[μg/l]亲和性[nm]s244.2-h08_k121c318s244.2-h08_n123c5114s244.2-h08_d95c1511s244.2-h08_r90c5535s244.2-h08_t40c6340s244.2-h08_v93c3121s244.2-h082008表iii.突变蛋白s244.2-h08和包含以下氨基酸交换的其突变体对c-met受体的spr-亲和性：thr40→cys(seqidno：22)、asn123→cys(seqidno：23)、asp95→cys(seqidno：24)、arg90→cys(seqidno：25)和lys121→cys(seqidno：26)。实施例10：使用位点定向随机方法的突变蛋白s225.4-k24的亲和性成熟基于突变蛋白s225.4-k24(seqidno：1)的变体的文库通过残基位置28、39、52、5、58、65和89的随机化以允许所有20种氨基酸出现在这些位置上来设计。文库基本按实施例1中的描述构建，但有以下修改：三个随机化的pcr片段是逐对采用以下脱氧核苷酸分别代替tl46、tl47、tl48和tl49产生的：k24_1：gccatgacggtggacacgcagnnsccgctgagcctctac(seqno.：27)(覆盖位置28)和k24_2：cagggtcgtgagggtsnngggtgtcaccgagac(seqno.:28)(覆盖位置39)、k24_3:gggggcaacctggaagccnnsgtcaccnnsaaccagnnsggccggtcccaggaggtg(seqno.：29)(覆盖位置52、55和58)和k24_4:gtattttcccggctcatcagttttctccaggacggcsnncacctcctgggaccggcc(seqno.：30)(覆盖位置65)、k24_5:gtgctcacgtggcatacatcnnsaggtcgcacgtgaaggac(seqno.：31)(覆盖位置89)和tl51bio(seqno.：3)。噬菌粒展示和选择采用噬菌粒基本上按实施例2中的描述进行，但有以下修改：靶蛋白是生物素化形式的无fc-部分的单体c-met受体(r&dsystems)，其允许经由固定在聚苯乙烯平板上的中性链亲和素(pierce)捕获靶标：噬菌粒复合物。选择使用以下进行：限制的靶标浓度(1.5nm和0.5nm和0.1nm生物素化的c-met受体)，或限制的靶标浓度(3μg/ml、1μg/ml和0.3μg/ml)与更短的孵育时间(10min)的组合，或使用高度过量的(10μm)从实施例5中描述的易错成熟获得的纯化的c-met特异性突变蛋白s244.2-h08(seqnr.：4)的竞争方法。进行了三轮选择。实施例11：使用高通量elisa筛选的c-met受体结合突变蛋白的亲和性筛选筛选基本上按实施例5的描述以可选的筛选设置进行，并具有以下修改：i)在聚苯乙烯平板上包被单克隆抗-t7抗体，并在与限制浓度的单体c-met受体-生物素(50nm、10nm和2.5nm)孵育之前，经由t7-标签捕获表达的突变蛋白。使用hrp(辣根过氧化物酶)-轭合的超级亲和素(extravidin)检测靶标的结合。ii)在中性链亲和素平板上捕获生物素化的c-met受体(1μg/ml)。在无限制的(60min)或限制的(5min)孵育时间之后，经由hrp-轭合的抗-t7mab(novagen)检测表达的c-met特异性突变蛋白的结合。iii)将含有c-met结合突变蛋白的提取物加热至70℃1小时。iv)在中性链亲和素平板上捕获生物素化的c-met受体(r&dsystems，2.5μg/ml)。将突变蛋白提取物与作为靶标结合竞争物的来自实施例5的高度过量的(1μm)纯化的c-met特异性突变蛋白s244.2-h08(seqno.：4)预孵育。经由hrp-轭合的抗-t7mab(novagen)检测表达的c-met特异性突变蛋白的结合。此类筛选的结果描绘于图8。按实施例12和13的描述选择的许多突变蛋白被鉴定为与充当亲和性成熟的基础的突变蛋白s225.4-k24(seqidno.：1)相比具有改善的对c-met受体的亲和性。使用此方法，鉴定了突变蛋白s261.1-l12、s261.1-j01、s261.1-l17(seqidno:32-34)。s261.1-l12、s261.1-j01、s261.1-l17的序列还和s225.4-k24(seqno.：1)和从实施例5中描述的易错成熟获得的突变蛋白s244.2-h08(seqno.：4)的序列一起描绘于图9。实施例12：加his-标签形式的c-met受体结合突变蛋白的产生经由0.75l生物反应器中的发酵罐培养的周质产生基本上根据实施例6进行，但有以下修改：相应突变蛋白编码于表达载体ptlpc47(图10)而不是ptlpc10。ptlpc47的载体元件与ptlpc10的相同，但具有以下修改：ptlpc47编码c-末端融合于六-his标签的tlc突变蛋白，并除去了n-末端融合的t7-标签。使用具有适当的床体积的柱和合适的设备根据生产商的建议，以单一步骤的ni-nta琼脂糖(ge)层析方案从周质级分中纯化突变蛋白。为了得到更高的纯度并除去任何聚集的重组蛋白，最后在pbs缓冲液存在下在superdex75hr10/30柱(24-ml床体积,amershampharmaciabiotech)上进行突变蛋白的凝胶过滤。汇集单体蛋白级分，通过sds-page检查纯度并用于进一步的生化表征。实施例13：使用表面等离子体共振光谱(spr)的亲和性测量亲和性测量基本上按实施例7的描述进行。采用s261.1-l12、s261.1-j01、s261.1-l17(seqidno：32-34)和从实施例4和5中描述的易错成熟获得的突变蛋白s244.2-h08(seqno.：4)的亲和性测量的结果概括于表iv。表iv.通过spr确定的来自实施例10和11中描述的第二亲和性成熟的选择的突变蛋白与来自第一亲和性成熟循环的突变蛋白s244.2-h08相比的亲和性改善。实施例14：通过流式细胞术在完整的细胞上对脂质运载蛋白突变蛋白进行亲和性评级基本上按实施例8中的描述在ht-29细胞(atcc)上滴定脂质运载蛋白突变蛋白。从中确定s261.1-l12、s261.1-j01、s261.1-l17(seqidno:32-34)的ec50值的滴定曲线描绘于图11，计算的ec50值概括于表v。克隆ec50[nm]s261.1-l122,3s261.1-j018,5s261.1-l172,8表v.通过在ht-29细胞上的facs滴定确定的本发明的选择的突变蛋白对c-met受体的ec50值。实施例15：使用hgf竞争elisa鉴定c-met受体特异性突变蛋白的非拮抗结合模式在竞争elisa中通过选择的c-met特异性突变蛋白评估了hgf(肝细胞生长因子,r&dsystems)和c-met受体之间相互作用的模式。因此，经由之前固定在聚苯乙烯平板的表面上的抗-人igg-fc特异性mab(jacksonimmunoresearch)捕获了恒定浓度的2.5μg/mlc-met受体-fc(r&dsystems)。接下来，将靶标与两步稀释系列中从100nm开始的c-met-特异性突变蛋白的稀释系列在室温下孵育1小时，结合在存在或不存在300nmhgf作为竞争物下发生。使用多克隆生物素化的抗-脂质运载蛋白1抗体(r&dsystems)检测结合的c-met受体特异性突变蛋白，使用多克隆抗-hgf-生物素抗体(r&dsystems)检测结合的hgf。在两种情况下，均采用hrp-轭合的超级亲和素(sigma)作为二级检测试剂。采用突变蛋白s261.1-l7(seqno.:34)的测量的结果充当实例并描绘于图12。从突变蛋白滴定曲线确定的kd值概括于表vi。表vi.通过竞争elisa确定的本发明的选择的泪脂质运载蛋白突变蛋白s261.1-l17对c-met受体的非拮抗能力和亲和性。实施例16：通过使用cd光谱确定c-met结合突变蛋白的热变性圆二色性测量基本上按国际专利申请wo2006/056464实施例14中的描述进行，但有以下修改：使用的波长为230nm，并且突变蛋白浓度为250μg/ml。泪脂质运载蛋白突变蛋白s261.1-l12、s261.1-j01、s261.1-l17(seqidno:32-34)和s244.2-h08(seqidno.：4)的熔化温度tm概括于表vi。表vi.通过圆二色性测量确定的本发明的选择的突变蛋白对c-met受体的熔化温度。实施例17：在位置123处具有未配对的半胱氨酸的c-met-特异性突变蛋白s261.1-l12c123的生产c-met-特异性突变蛋白s261.1-l12_c123(seqno.：35)的制备性生产基本上按实施例6中的描述进行，但有以下修改：氨基酸asn123被改变为半胱氨酸以引入未配对的半胱氨酸用于随后的位点定向轭合。半胱氨酸123是根据转换实施例9中描述的半胱氨酸筛选的结果选择的，与没有未配对的半胱氨酸的原始突变蛋白s261.1-l12(seqno.：32)相比，其展现良好的表达产量和亲和性。实施例18：hynic向c-met-特异性突变蛋白s261.1-l12c123的位点定向轭合来自实施例17的纯化的突变蛋白s262.1-112_c123(seqnr.：35)以在pbs缓冲液ph7.4中的0.8mg/ml的浓度使用，并通过加入100mmtcep(sigma)至终浓度1mm活化未配对的半胱氨酸。在室温下孵育2小时后，通过采用nap-5柱(ge)的凝胶过滤根据生产商的建议除去未反应的过量tcep。加入10倍摩尔过量的hynic(3-n-马来酰亚胺-6-肼吡啶盐酸盐，购自solulink)并在室温下孵育2h。为了除去轭合的突变蛋白中未反应的hynic，在ultracentricon(amicon)中浓缩反应混合物，并使用适当体积的pbs缓冲液洗涤至少5次。实施例19：通过流式细胞术在完整的细胞上对hynic-轭合的c-met-特异性突变蛋白s261.1-l12c123进行亲和性测量基本上按实施例8中的描述在ht-29细胞(atcc)上滴定含和不含轭合的hynic的c-met-特异性突变蛋白s261.1-l12_c123(seqno.：35)。从中确定ec50值的滴定曲线描绘于图13，计算的ec50值概括于表vii。克隆ec50[nm]s261.1-l12_c1238,6s261.1-l12_c123_hynic8,3表vii.通过在ht-29细胞上的facs滴定确定的本发明的选择的突变蛋白对c-met受体的ec50值和标准偏差。实施例20：c-met-特异性突变蛋白的ph稳定性来自实施例12的纯化的突变蛋白s261.1-j01在ph3至ph9.2的范围中的不同ph下孵育60min。中和至ph7.4以后，经由尺寸排阻层析通过采用分析型superdex75柱(ge)根据生产商的建议分析突变蛋白。如通过hplc-sec判断的，未能在孵育时间段内检测到突变蛋白的变化，在突变蛋白的pi附近的范围ph5-6除外，发生了一定程度的二聚化，如图14所描绘的。实施例21：位置饱和诱变在亲和性成熟的泪脂质运载蛋白突变蛋白l17、o24、m02、k22、a22、k15、l03、o07和k06的序列位置26、27和29处进行位点特异性诱变，以评估是否可显著影响结合亲和性。如图15所示，所有生成的突变体显示基本相同的亲和性。实施例22：使用位点定向随机方法的突变蛋白s261.1-l17的亲和性成熟基于突变蛋白s261.1-l17(seqidno：34)的8x108个变体的文库通过位置26、27、29、30、32、33、34和79的随机化以允许所有20种氨基酸出现在这些位置上来设计。文库基本上按国际专利申请pct/ep2007/057971、公布为wo2008/015239的实施例1中的描述构建，但有以下修改：对于随机化，使用脱氧核苷酸l12-1：gaaggccatgacggtggacnnknnkgacnnknnkagcnnknnknnktcggtgacacccatcacc(seqidno：50)；l12-2：cacgtgagcacctccgtamnncgtgtattttcccggctc(seqidno：51)；和l12-3：acggaggtgctcacgtggcatacatccagagg(seqidno：52)代替pct/ep2007/057971中公开的那些。噬菌粒展示和选择采用噬菌粒基本上按国际专利公布wo2005/019256的实施例3中的描述进行，但有以下修改：靶蛋白(c-met受体fc,r&dsystems)以限制浓度(40pm和6pm和1pm)使用并作为fc-融合蛋白呈递至文库，随后使用蛋白g珠(dynal)捕获噬菌体-靶标复合物，或在将靶标-珠复合物呈递至文库噬菌粒之前，首先以限制浓度(50ng/ml和10ng/ml和1ng/ml)将靶标捕获至蛋白g珠。在酸性条件并随后在碱性条件下洗脱c-met结合的文库噬菌体。进行三轮选择。实施例23：使用高通量elisa筛选的c-met受体结合突变蛋白的亲和性筛选筛选基本上按实施例5中的描述以可选的筛选设置进行，并具有以下修改：i)在聚苯乙烯平板上以5μg/ml的浓度包被单克隆抗-t7抗体，并在与限制浓度的c-met受体-fc(1nm、0.2nm和0.1nm)孵育之前，经由t7-标签捕获表达的突变蛋白。使用hrp(辣根过氧化物酶)-轭合的山羊-抗人igg-fc特异性抗体检测靶标的结合。ii)在与c-met受体-fc靶标形成复合物之前，将含有c-met结合突变蛋白的提取物加热至70℃1小时。在此设置中，经由以5μg/ml浓度固定在聚苯乙烯平板上的小鼠抗人igg-fc特异性单克隆抗体捕获c-met受体-fc。按以上描述选择的许多突变蛋白被鉴定为与充当亲和性成熟的基础的突变蛋白s261.1-l17(seqidno:34)相比具有改善的对c-met受体的亲和性。使用此方法，鉴定了突变蛋白s318.1-c10、s318.1-n21、s318.1-l13、s318.1-a16、s318.2-i24、s318.4-m11、s318.1-g18和s318.1-o12(seqidno:42-49)。实施例24：通过流式细胞术在完整的细胞上对c-met-特异性突变蛋白进行亲和性测量在表达并使用融合于相应突变蛋白的c-末端的strep-标签的亲和层析纯化突变蛋白(参阅实施例6)之后，基本上按实施例8中的描述在ht-29细胞(atcc)上滴定c-met-特异性突变蛋白s318.1-c10、s318.1-l13、s318.1-a16、s318.2-i24和s318.1-o12(seqidno：42、44、45、46和49)，并将它们的结合亲和性与在c-末端携带his6-标签的突变蛋白s261.1-l17(seqidno：34)的亲和性进行比较。从中确定ec50值的滴定曲线描绘于图13，计算的ec50值概括于表viii。表viii.通过在ht-29细胞上的facs滴定确定的本发明的选择的突变蛋白对c-met受体的ec50值和标准偏差。实施例25：通过使用cd光谱确定c-met结合突变蛋白的热变性圆二色性测量基本上按国际专利申请wo2006/056464实施例14中的描述进行，但有以下修改：使用的波长为230nm，并且突变蛋白浓度为250μg/ml。泪脂质运载蛋白突变蛋白s318.1-c10(seqidno：42)和s318.1-o12(seqidno：49)的熔化温度tm概括于表ix，并与它们所衍生自的突变蛋白s261.1-l17(seqidno：34)(配备有his6-标签)的熔化温度进行了比较。表ix.通过圆二色性测量确定的本发明的选择的突变蛋白对c-met受体的熔化温度。实施例24和25的结果显示，突变蛋白s318.1-c10与充当其产生基础的突变蛋白s261.1-l17具有大致相同的结合亲和性，但同时突变蛋白s138.1-c10具有比突变蛋白s261.1-l17更高的稳定性。本文例证性地描述的发明可在缺乏未在本文具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制下适当地实施。因此，应广阔而不是限制性地理解例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等。另外，本文采用的术语和表达用作描述性术语而不是限制性术语，并且此类术语和表达的使用不意欲排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应认识到，可在所要求保护的发明的范围内进行多种修改。因此，应理解，虽然已通过优选的实施方案和可选的特征具体地公开了本发明，但是本领域技术人员可借助本文公开的其中实施的发明的修改和变化，并且此类修改和变化视为在本发明范围内。本文广泛地并且在属别上描述了本发明。落入属别公开内容的更窄的物种和亚属分组中的每一种也形成本发明的部分。这包括附带条件或否定限制的对本发明的属别描述，即，从该属移除任何主题，而无论是否在本文具体地提及所移除的材料。此外，当以马库什组的方式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将理解，本发明还因此以马库什组的任何个体成员或成员的亚组的方式描述。本发明的进一步的实施方案将从下列权利要求中变得明显。序列表<110>皮里斯股份公司<120>具有对人c-met受体酪氨酸激酶的亲和性的泪脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法<130>lc12310013p-d<160>52<170>patentin版本3.3<210>1<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s225.4-k24)<400>1alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrprometthrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualalys354045valthrmetasnglnileglyargserglngluvallysalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileileargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>2<211>24<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物tl50bio(5'组装)<400>2tatctgaaggccatgacggtggac24<210>3<211>24<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物tl51bio(3'组装)<400>3tgcccacgagccacacccctggga24<210>4<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s244.2-h08)<400>4alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileserargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>5<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白突变蛋白的突变蛋白(s244.2-l01)<400>5alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnthrproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileileargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>6<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白突变蛋白的突变蛋白(s244.4-n05)<400>6alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspproglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrprometthrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>7<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白突变蛋白的突变蛋白(s244.5-j05)<400>7alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrprometthrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglyargtyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>8<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白突变蛋白的突变蛋白(s244.8-i20)<400>8alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthralaleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvallysalavalleu505560glulysthraspgluproglyargtyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly<210>9<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白突变蛋白的突变蛋白(s244.8-i07)<400>9alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnvalproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrmetasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglyargtyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>10<211>40<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_t40c正向<400>10cgtctcggtaacacccatatgcctcacgaccctggaaggg<210>11<211>40<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_t40c反向<400>11cccttccagggtcgtgaggcatatgggtgttaccgagacg<210>12<211>42<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_d95c正向<400>12caggtcgcacgtgaagtgccactacatcttttactctgaggg<210>13<211>42<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_d95c反向<400>13ccctcagagtaaaagatgtagtggcacttcacgtgcgacctg<210>14<211>37<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_r90c正向<400>14cgtggcatacatcagctgctcgcacgtgaaggatcac<210>15<211>40<212>dna<213>人工<220>37<223>寡核苷酸引物h08_r90c反向<400>15gtgatccttcacgtgcgagcagctgatgtatgccacg<210>16<211>40<212>dna<213>人工<220>33<223>寡核苷酸引物a22_k121c正向<400>16ggcagagacccctgcaacaacctggaagccttg<210>17<211>33<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物a22_k121c反向<400>17caaggcttccaggttgttgcaggggtctctgcc<210>18<211>36<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物a22_n123c正向<400>18ggcagagaccccaagaactgcctggaagccttggag<210>19<211>36<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物a22_n123c反向<400>19ctccaaggcttccaggcagttcttggggtctctgcc<210>20<211>40<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_v93c正向<400>20catcagcaggtcgcactgcaaggatcactacatcttttac<210>21<211>40<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_v93c反向<400>21gtaaaagatgtagtgatccttgcagtgcgacctgctgatg<210>22<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s244.2-h08_c40)<400>22alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilecysleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileserargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>23<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s244.2-h08_c123)<400>23alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileserargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasncysleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>24<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s244.2-h08_c95)<400>24alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileserargserhisvallyscyshistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>25<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s244.2-h08_c90)<400>25alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilesercysserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>26<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s244.2-h08_c121)<400>26alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval20253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provalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserproglyhishishishishishis145150155<210>39<211>158<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s261.1-l12，具有his6标签)<400>39alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualamet354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserproglyhishishishishishis145150155<210>40<211>158<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s261.1-j01，具有his6标签)<400>41alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530thrproleuthrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualamet354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserproglyhishishishishishis145150155<210>41<211>158<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s261.1-l17，具有his6标签)<400>41alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530serproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilehisargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserproglyhishishishishishis145150155<210>42<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s318.1-c10)<400>42alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530serproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthrleutyrglyglyalahis65707580valalatyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>43<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s318.1-n21)<400>43alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530serproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthrleutyrglyglyalahis65707580valthrtyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>44<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s318.1-l13)<400>44alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530serproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthrsertyrglyglyalahis65707580valthrtyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>45<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s318.1-a16)<400>45alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspvalglyaspleuglyserargvalvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthrleutyrglyglyalahis65707580valalatyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>46<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s318.1-i24)<400>46alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspproglyaspileargserleuilevalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthrleutyrglyglyalahis65707580valalatyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>47<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s318.1-m11)<400>47alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspsergluaspalapheservalthrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthrleutyrglyglyalahis65707580valalatyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>48<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s318.1-g18)<400>48alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspvalvalasptrpargserglnvalargserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valthrtyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>49<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人泪脂质运载蛋白的突变蛋白(s318.1-o12)<400>49alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspglyserasptrpgluservalphealaserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthrleutyrglyglyalahis65707580valalatyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>50<211>64<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物l12_1<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(23)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(29)..(30)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(32)..(33)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(38)..(39)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(41)..(42)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(44)..(45)<223>n是a、c、g或t<400>50gaaggccatgacggtggacnnknnkgacnnknnkagcnnknnknnktcggtgacacccatcacc<210>51<211>39<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物l12_2<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>n是a、c、g或t<400>50cacgtgagcacctccgtamnncgtgtattttcccggctc<210>51<211>32<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物l12_3<400>51acggaggtgctcacgtggcatacatccagagg当前第1页12