一种POSS‑PEG杂化水凝胶、其制备方法及应用与流程

本发明涉及涉及组织工程领域，更特别地，涉及一种poss-peg杂化水凝胶及其制备方法以及用其制备的组织工程支架。

背景技术：

组织工程技术在生物医学应用中拥有巨大的潜力，如修复、替换受损或患病组织的生物功能。组织工程技术成功的关键因素之一是选择一个合适的支架材料。为了实现组织重建，支架材料应当具备以下条件：(1)良好生物相容性；(2)较强的机械性能；(3)较高的孔隙率和足够的孔径；(4)生物可降解性以及合适的降解速率。

聚乙二醇(peg)水凝胶是一类非常有吸引力的组织工程支架材料，其生物相容性好、无毒、免疫原性低、对蛋白质抗吸附，可通过肾排出体外，在体内不会有积累。peg水凝胶的结构、力学行为及降解性可通过peg的化学和加工条件来控制；其生物功能则可通过在peg水凝胶内部嵌入生物活性分子来获取，例如嵌入基质金属蛋白酶(mmp)底物肽(mmp(w)x)，使peg水凝胶具有酶敏感性，利用种子细胞自身分泌的蛋白酶(尤其是mmps)，促进细胞外基质降解，促使活性分子释放，有利于种子细胞在支架的生长、粘附。然而，peg水凝胶的机械强度差，其机械强度远小于生物组织。

多面体低聚倍半硅氧烷(poss)是一种分子水平上的纳米杂化材料，分子尺寸在1-3nm之间，由核心的si-o-si键组成的无机骨架和外围的有机取代基组成有机-无机杂化结构，外围的有机取代基赋予了poss良好的分子可设计。poss纳米粒子能增强聚合物韧性、耐温性能、力学性能，且其无毒无味，具有良好的生物相容性，被认为是新一代生物医用材料。目前所研究的poss杂化水凝胶都是通过光聚合或使用的六亚甲基二异氰酸酯(hdi)或二苯基甲烷二异氰酸酯(mdi)等作为交联剂进行缩合反应制备得到。这些制备方法的主要缺点是所用的光引发剂、hdi、mdi等具有毒性，且反应需要在有机溶剂中进行，对材料的体外生物相容性研究只能局限于2d细胞培养中。

因此，需要开发出具有更好力学性能的水凝胶，并且在制备过程中不使用有机溶剂成胶，从而使细胞在保持最大活性的同时被封装到材料中。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明提供了一种poss-peg杂化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

s1：将马来酰亚氨基功能化的四臂聚乙二醇(4-arm-peg-mal)与poss-sh进行michael加成反应得到poss-peg预聚物；

s2：使用酶敏感的基质金属蛋白酶底物肽(mmp(w)x)作为交联剂与所述poss-peg预聚物通过micheal加成反应交联成胶，得到所述poss-peg杂化水凝胶。具体反应过程如图10的反应式所示。

在一个优选实施方案中，mmp(w)x肽的序列为：ac-gcrd-gpqg↓iwgq-dgcg-nh2。

在一个优选实施方案中，所述4-arm-peg-mal的分子量为10kda～40kda。

在一个实施方案中，s1中所述4-arm-peg-mal与所述poss-sh之间的michael加成反应在四氢呋喃中进行。

在一个优选实施方案中，s1中所述poss-sh与所述4-arm-peg-mal之间的摩尔比为0.25-1。

在一个优选实施方案中，s1包括以下步骤：

s11：将所述4-arm-peg-mal与所述poss-sh溶解于四氢呋喃中；

s12：室温搅拌3.5小时使所述4-arm-peg-mal与所述poss-sh发生michael加成反应；

s13：去除所述四氢呋喃，即得到所述poss-peg预聚物。

在一个实施方案中，s2中所述mmp(w)x与所述poss-peg预聚物之间的交联反应在乙醇胺的水溶液中进行。

在一个优选实施方案中，所述乙醇胺的浓度为3-10mm。

在一个优选实施方案中，所述乙醇胺溶液的ph为7-8，优选为7.4。

在一个优选实施方案中，s2中所述mmp(w)x与所述poss-peg预聚物之间重量比为1:3-20，更优选地，可将mmp(w)x的功能基与poss-peg预聚物的功能基的比例为1:1。

在一个实施方案中，s2中的反应温度为37℃。

在一个实施方案中，s2中的乙醇胺水溶液中还添加了药物或种子细胞。

本发明还涉及上述方法制备的poss-peg杂化水凝胶。

本发明还涉及上述poss-peg杂化水凝胶在制备组织工程支架中的应用。

本发明的poss-peg杂化水凝胶机械强度好，且其机械强度可通过改变马来酰亚氨基功能化的四臂聚乙二醇(4-arm-peg-mal)分子量、poss-sh与4-arm-peg-mal的摩尔比例进行精细调控，同时只需在低浓度的三乙醇胺缓冲液中制备而成，成胶时间很快，在保证基本的理化性质的前提下尽可能地降低了对其上搭载的种子细胞或药物的损害或损失。

附图说明

图1为poss-peg杂化水凝胶的扫描电镜照片；

图2为poss-peg杂化水凝胶的储能模量(g’)的振荡应力扫描图谱；

图3为poss-peg杂化水凝胶的储能模量(g’)的动态频率扫描图谱；

图4为poss-peg杂化水凝胶溶胀曲线；

图5为poss-peg杂化水凝胶的平衡溶胀比柱状图；

图6为poss-peg杂化水凝胶降解率统计图；

图7为以4-arm-peg-mal分子量20kda制备的poss-peg杂化水凝胶4周内降解曲线；

图8为poss-peg杂化水凝胶体外细胞培养cck细胞活力测定图；

图9为poss-peg杂化水凝胶体外细胞培养细胞的活死细胞染色照片；

图10为本发明的方法的化学反应式。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.poss-peg杂化水凝胶的制备

poss-peg杂化水凝胶通过以下方法来制备：将4-arm-peg-mal(北京健凯科技有限公司)和poss-sh(sigma公司)溶解于3ml四氢呋喃中，室温搅拌3.5小时后除去溶剂得poss-peg预聚物；然后将poss-peg预聚物与基质金属蛋白酶底物肽(上海吉尔生化科技公司)溶解于3mlph7.4的三乙醇胺中，混合均匀，得预成胶溶液；最后将上述预成胶溶液转移至5个600μl模具中，37℃生化培养箱中反应，制备得到水凝胶。poss-peg预聚物制备过程中的4-arm-peg-mal的分子量、4-arm-peg-mal、poss-sh的量如表1所示；poss-peg杂化水凝胶制备过程中的poss-peg预聚物和基质金属蛋白酶底物肽的量、三乙醇胺浓度以及成胶时间如表2所示。

表1实施例1-5中4-arm-peg-mal的分子量、4-arm-peg-mal、poss-sh的量

表2实施例1-5中poss-peg预聚物和基质金属蛋白酶底物肽的量、三乙醇胺浓度以及成胶时间

在实施例1-5中，都能成胶，并且成胶时间都在20min以内。所得到的poss-peg杂化水凝胶在扫描电镜下进行观察，结果如图1所示，在poss-sh与4-arm-peg-mal的摩尔比为0.25、0.5和1的情况下，所实验的各分子量的4-arm-peg-mal都能与poss-sh反应，且其反应产物能与基质金属蛋白酶底物肽交联形成多孔状的交联结构。

2.poss-peg杂化水凝胶的理化性质

1)机械强度

将水凝胶测试样(n＝3)用超纯水溶胀至平衡，滤纸擦干表面水分，采用流变仪解析水凝胶力学性能，3个测试样取平均值。图2为水凝胶材料的储能模量(g’)的振荡应力扫描图谱，图3为储能模量(g’)的动态频率扫描图谱。由图2和3可看出，采用本发明方法制备的水凝胶材料在所受应力从0.1pa增加到20pa时，储能模量(g’)随应力的变化没有明显变化，扫描频率范围为1hz到2hz时储能模量(g’)也无明显变化，表明水凝胶材料交联良好。相较于未加入poss的纯peg水凝胶，poss-peg杂化水凝胶机械强度更大，且机械强度随poss含量增大而增大。

2)亲水性

将水凝胶测试样(n＝3)冷冻干燥，准确称取其重量。将干水凝胶沉浸在0.9％氯化钠注射液(10ml)中，置于37℃水浴。在预定的时间，取出溶胀的水凝胶，用滤纸擦干表面水分后称重，直至水凝胶重量恒定不变。水凝胶的溶胀百分率(％)＝(溶胀后水凝胶质量-溶胀前水凝胶质量)/溶胀前水凝胶质量×100％，3个测试样取平均值。图4为水凝胶材料溶胀曲线；图5为水凝胶材料的平衡溶胀比柱状图。由图4和5可看出本发明方法制备的水凝胶材料在前10h已经达到较高的溶胀比，并在168h后达到溶胀平衡。尽管poss-peg杂化水凝胶的平衡溶胀比随poss含量增大而减小，但本发明方法制备的水凝胶材料平衡溶胀比在12至33之间，表明其仍具有良好的亲水性。

3)酶降解性

将水凝胶测试样(n＝3)冷冻干燥，准确称取其重量。将干水凝胶沉浸在0.01m磷酸盐缓冲液(pbs，ph＝7.4,9ml)和重组人类mmp-2(200ng/ml,1ml)，纯peg水凝胶作为空白组，置于37℃水浴。30天后蒸馏水漂洗，冷冻干燥，称重。计算每组水凝胶在溶液中的累计降解百分率(％)＝(降解前水凝胶质量-剩余水凝胶质量)/降解前水凝胶质量×100％，3个测试样取平均值。图6中a为降解率图；图7为以4-arm-peg-mal分子量20kda制备的poss-peg杂化水凝胶4周内降解曲线。由图6和7可看出本发明方法制备的水凝胶材料降解率在28％至48％之间，表明水凝胶材料具有酶降解性，并且随着poss含量的增大，poss-peg杂化水凝胶降解率越低、降解速度越慢。

3.搭载人脐静脉内皮细胞(huvec)的poss-peg杂化水凝胶

制得的不同poss-sh与4-arm-peg-mal的摩尔比例预成胶液各3ml，与人脐静脉内皮细胞(huvec)均匀混合，细胞密度为1×10⁶/ml。取64μl置于96孔细胞培养板中，高度为2mm，5％co2恒温培养箱37℃孵育30min，加入200ul含10％胎牛血清的低糖dmem培养基，继续孵育，在第1天和第4天取出样本，进行活死细胞染色测试细胞活性，应用荧光显微镜分析图像，观察细胞活性及形态；并用cck-8进行细胞活力测试，应用分光光度计检测吸光度推算活细胞数目。纯peg水凝胶为对照组。图8为cck细胞活力测定图；图9为体外细胞培养活死细胞染色图。结果显示，细胞在水凝胶内部封装均匀，培养四天后均有较高的细胞活力，表明poss-peg水凝胶材料无毒且具有良好的生物相容性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。