一种稳定表达NS1蛋白细胞株的构建方法与流程

本发明属于医学分子生物学领域。具体涉及一种稳定表达ns1蛋白(non-structural1protein,ns1)肺癌细胞株的构建方法。

背景技术：

慢病毒(lentivirus)载体是以i型人类免疫缺陷病毒为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，需要利用表达载体和包装质粒共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装。包装好的病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液中包含高滴度的病毒颗粒，可以直接用于宿主细胞的感染。目的基因通过病毒感染进入到宿主细胞之后，整合到基因组，从而持续的高水平的表达目的基因。在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过慢病毒介导的转染能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效表达。

禽流感病毒是一种a型流感病毒，属于正粘病毒科，流感病毒属。a型流感病毒的基因组由8个节段的单股负链rna构成，编码11-12种蛋白，包括：ha、na、m1、m2、ns1、ns2、np、pb1、pb2、pa，以及np40和pb1-f2。其中ns1蛋白(non-structuralprotein1)由流感病毒第8个节段的rna编码，含202-237个氨基酸，相对分子量约为28kd，在不同病毒株之间有差异。最近的结构解析发现这主要是与其特异的构造有关，ns1蛋白由三部分组成：rna结合结构域(rnabindingdomain，rbd)、效应结构域(effectordomain，ed)以及两者的连接区域(linkerregion，lr)，灵活可变的连接区域可以使ns1蛋白呈现不同的构象，从而完成与不同rna和蛋白的结合。ns1的rna结合结构域(rbd)由73个氨基酸组成，能够结合异源rna，包括病毒基因组rna、病毒mrna的5’非翻译区、poly(a)rna和外源dsrna；ns1的c末端效应结构域(ed)是ns1与宿主相互作用的主要结构域，具有阻断宿主mrna剪接、多聚腺苷酸化和核转运等功能。

ns1蛋白与流感病毒的毒性密切相关，在调控流感病毒致病性方面发挥着重要的作用。a型流感病毒的ns1蛋白具有影响宿主细胞凋亡的作用。其影响宿主细胞凋亡的过程还没有完全被阐述清楚，已有的研究发现ns1蛋白同时具有促进凋亡和抑制凋亡的双重作用。在感染早期，ns1蛋白通过降低ifn的表达量以抑制ifn的下游反应，从而抑制宿主细胞凋亡；同时，ns1也可以与pi3k相互作用，激活pi3k/akt信号通路，从而抑制jnk依赖、bax介导的宿主细胞凋亡。ns1还可以通过很多其他途径影响细胞的凋亡。据报道，在病毒感染时，激活状态的pkr对于凋亡有重要作用，而ns1蛋白可以直接结合并抑制pkr激活的促凋亡反应；ns1蛋白n端rna结合区域可以与细胞内dsrna结合，从而抑制起促凋亡作用的oas/rnasel通路；有研究发现ns1可以抑制p53调控因子的活性，从而抑制p53调节的凋亡作用；ns1直接与hgbp1(humanguanylate-bindingprotein1)相互作用，导致hgbp1的gtpase活性降低，间接抑制了凋亡反应。虽然凋亡过程经常被认为是宿主细胞自身为了限制病毒复制，而采取的一种抗病毒反应，但是在a型流感病毒感染细胞中凋亡过程的作用还不是很清楚。

技术实现要素：

本发明的目的是利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达ns1蛋白的细胞株，该细胞株为研究ns1蛋白的生物学功能提供一个很好的工具。

本发明采用的技术方案是：一种稳定表达ns1蛋白细胞株的构建方法，包括如下步骤：

1)ns1基因的扩增；

2)将ns1基因与载体plenti-cmv-egfp-3flag-pgk-puro连接，构建重组慢病毒表达质粒plenti-cmv-ns1-egfp-3flag-pgk-puro；

3)将重组慢病毒表达质粒plenti-cmv-ns1-egfp-3flag-pgk-puro与病毒包装质粒共转染293t细胞，经培养、出毒、收取上清液，过滤，得包装好的重组慢病毒cmv-gfp-l.v.；

4)将包装好的重组慢病毒cmv-gfp-l.v.转染a549细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行细胞免疫荧光及westernblot鉴定，获得稳定表达ns1蛋白细胞株。

上述的一种稳定表达ns1蛋白细胞株的构建方法，所述的步骤1)，以ns1-f和ns1-r为特异性引物，添加酶切位点ecori，以质粒pegfp-n1-ns1为模板，进行pcr扩增；所述的特异性引物ns1-f和ns1-r的序列为：

ns1-f:5'ccggaattcatggattccaacactgtgt3'

ns1-r:5'ccggaattccgaacttttgactcaattgt3'

上述的一种稳定表达ns1蛋白细胞株的构建方法，pcr扩增体系为：

pcr反应程序：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，4℃保温，30个循环。

上述的一种稳定表达ns1蛋白细胞株的构建方法，步骤3)中，所述的病毒包装质粒是plp1、plp2和plp。

本发明的有益效果是：

1.本发明以重组慢病毒为载体，将其感染a549人肺腺癌细胞，筛选获得能稳定表达ns1蛋白的细胞株，所述ns1蛋白融合表达egfp、flag标签，方便ns1蛋白表达的检测。

2.本发明建立了能稳定表达ns1蛋白的a549细胞株，该细胞株为进一步深入研究ns1蛋白的生物学特性及禽流感病毒的致病机制奠定了坚实基础。

3.本发明构建一种带有标签的过表达ns1蛋白的细胞株，为ns1蛋白生物学特性及功能的研究提供一个良好的工具，也望成为禽流感治疗的一个理想模型。

附图说明

图1是pegfp-n1-ns1的双酶切结果图。

图2是plenti-cmv-egfp-3flag-pgk-puro的载体酶切结果；

其中，1：载体酶切后片段；2：1kbdnaladdermarker：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp。

图3是plenti-cmv-ns1-egfp-3flag-pgk-puro表达载体的结构示意图。

图4是a549、转染空病毒载体的细胞株、ns1稳定表达株的免疫荧光鉴定；

其中，a：a549；b：转染空病毒载体的细胞株；c：ns1稳定表达株。

图5是ns1稳定表达株的westernblot鉴定；

其中，1：marker；2：a549blank；3：a549h102；4：a549h4438。

具体实施方式

(一)ns1基因扩增

1、ns1基因pcr扩增

根据genebank中ns1基因序列(genbank:aat90838.1)，利用软件lsprimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)设计ns1基因的特异性引物ns1-f和ns1-r，添加酶切位点ecori，特异性引物ns1-f和ns1-r的序列为：

ns1-f:5'ccggaattcatggattccaacactgtgt3'

ns1-r:5'ccggaattccgaacttttgactcaattgt3'

以本实验室保存的pegfp-n1-ns1质粒为模板，进行pcr扩增，pcr反应体系为：

pcr反应程序：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，4℃保温，共计30个循环。

2、dna琼脂糖凝胶电泳

配置1.5％的琼脂糖，微波炉加热使琼脂糖颗粒完全溶解；将洗净、干燥的制胶板水平放置在工作台上；混匀，灌胶，插入梳子，避免产生气泡；待凝胶凝固后，小心拔去梳子；将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液；将pcr产物上样，经110v电泳30min。

3、pcr产物凝胶回收

按照天根公司的琼脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书进行dna回收。

(二)构建重组慢病毒表达质粒plenti-cmv-ns1-egfp-3flag-pgk-puro

1、plenti-cmv-egfp-3flag-pgk-puro载体酶切

将plenti-cmv-egfp-3flag-pgk-puro载体用ecorⅰ酶切，酶切体系于37℃水浴过夜，电泳，将正确的目的条带进行凝胶回收。酶切体系如下：

2、ns1基因与plenti-cmv-egfp-3flag-pgk-puro载体连接

将(一)中凝胶回收后的ns1基因与酶切后的载体plenti-cmv-egfp-3flag-pgk-puro，在16℃过夜反应，构建重组慢病毒表达质粒plenti-cmv-ns1-egfp-3flag-pgk-puro。t4酶连接体系如下：

3、质粒转化感受态大肠杆菌e.colidh5α

取出e.colidh5α感受态细胞，插入碎冰中溶解；将10μl构建好的重组慢病毒表达质粒plenti-cmv-ns1-egfp-3flag-pgk-puro加入50μl感受态细胞，轻轻旋转混匀，冰浴30min；于42℃水浴中热休克大肠杆菌45s，迅速移入湿冰中，静置2min；加入已37℃预热无抗生素的soc培养液500μl，以180rpm转速于37℃恒温箱摇床培养1h。取120μl已转化的感受态细胞涂于含100μg/ml氨卞青霉素的lb琼脂平板上，将平板置于室温待其干燥后，倒置于37℃的培养箱中过夜培养12-16h，检查各培养皿中是否出现菌落。挑选琼脂平板上的单菌落接种到5ml氨苄抗性的lb培养基中，37℃摇床1800rpm培养过夜，培养时间不能超过16h。

4、转化子的分子生物学鉴定

以提取的转化菌株的基因组为模板进行pcr检测，回收产物进行测序。测序正确的菌液一部分冻存保菌，于-80℃长期保存。另一部分菌液提质粒。

5、plenti-cmv-ns1-egfp-3flag-pgk-puro重组菌株的质粒提取

测序正确的重组菌株进行质粒提取，得到plenti-cmv-ns1-egfp-3flag-pgk-puro重组慢病毒表达质粒。用nanodrop测定a260及a280，计算核酸纯度及核酸浓度分别为a260/280＝1.92，浓度为350ng/μl。

(三)重组慢病毒cmv-gfp-l.v.的获得

1、重组慢病毒的包装

将构建好的重组慢病毒表达质粒plenti-cmv-ns1-egfp-3flag-pgk-puro和病毒包装辅助质粒plp1、plp2、plp共转染293t细胞(转染plenti-cmv-egfp-3flag-pgk-puro空病毒载体作为对照)。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为5×10⁵细胞，重新接种10ml于10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养24h，待细胞密度达90％-95％时即可用于转染。转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。

向灭菌2ml离心管中加入所制备的plenti-cmv-ns1-egfp-3flag-pgk-puro载体4μg，以及病毒包装质粒plp1、plp2、plp各4μg，与1.5ml的无血清opti-mem培养基混合均匀，在室温下温育5分钟。取48μlfugenehd试剂在另一管中与1.5mlopti-mem混合，室温下温育5分钟。将上述两种溶液进行混合，室温下温育20分钟，形成dna与fugenehd转染复合物。将混合液转移至293t细胞的培养液中，于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。24h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基10ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养24h。24h后更换无抗生素的完全培养基继续培养。

2、重组慢病毒的收集及浓缩

转染48h后，收集含有病毒的培养液到50ml无菌离心管中，再补加10ml新鲜完全培养液至还能产毒的细胞中；转染72h后再次收集含有病毒的培养液，将两次收集的培养液于4℃离心，3000rpm，15min。病毒上清液用0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片，滤液4℃离心，50000×g，90min，去除上清，加入100μl完全培养液，用200μl枪头缓慢充分重悬后，将病毒浓缩液分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存，获得重组慢病毒cmv-gfp-l.v.。

3、重组慢病毒的滴度测定

第一天在96孔板每个孔接种4×10⁴个293t细胞，第二天在ep管中做10倍梯度稀释，稀释方法为：每种病毒准备8个1.5mlep管，每管加入297μl完全培养液，向第一个管中加入33μl病毒原液，混匀后，吸取30μl加入第二个管混匀。依此类推，做8个稀释度(10-10^-6)。弃去96孔板中原有的培养液，每个稀释度重复3个孔，每孔加入稀释好的病毒液100μl并做好标记。第五天用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出最后两个能观察到荧光的孔内荧光细胞数，计算3个重复孔内的总数之和并计算出平均数，假设为a(倒数第二个能见荧光孔的荧光细胞平均数)和b(倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数)。慢病毒滴度计算公式：病毒滴度(tu/ml)＝(a+b×10)×1000/2/a孔病毒量μl。经计算，病毒滴度为4.62×10⁷tu/ml。

(四)稳定转染细胞株的筛选

1、cmv-gfp-l.v.病毒感染a549最适条件优化

通过实验得知，a549细胞感染慢病毒cmv-gfp-l.v.，moi10，moi20时感染效率60％-70％，moi40时感染效率高，都达到80％以上。以感染效率高、moi值低、对细胞毒性低为前提，最佳感染条件：a549细胞选择moi20-40进行后续实验。

2、稳定转染细胞株筛选

复苏培养a549细胞至状态良好，转染前将a549细胞按30％汇合度接种到24孔板，a549细胞配成4×10⁴cells/ml细胞悬液，待铺板。每孔铺500μl，即2×10⁴cells/well，铺1块24孔板。12～20小时后感染病毒，病毒液滴度4.62×10⁷tu/ml，病毒量17.3μl。每孔加10μl1mg/mlpolybrene，最终在细胞样品中polybrene终浓度为5μg/ml，感染12-20小时后换培养基：弃去培养基，每孔加入2ml新鲜的培养基。在感染细胞72小时后，通过加入并维持2ug/ml的嘌呤霉素(puromycin)杀死未被有效感染的细胞；每隔2-3天换一次终浓度2ug/mlpuromycin新鲜培养基；倒置显微镜下观察，进行亚克隆筛选，挑选出正常生长细胞群传代，逐步放大培养；从而在puromycin药物的维持下筛选阳性细胞株。

3、阳性细胞株的检测

用荧光显微镜对阳性细胞进行免疫荧光鉴定(见图4)。对阳性细胞进行扩大培养后提取总蛋白，用flag单克隆抗体作为一抗，进行westernblot鉴定(见图5)。最后获得稳定转染ns1基因的a549细胞株。