一种靶向IGF‑IR基因的sgRNA及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种靶向igf-ir基因的sgrna及其应用。

背景技术：

新近研究发现igf信号通路中关键信号分子igf-ir，具有癌胚性，与肝癌进展间存在密切关系，但其基因转录或活化干预是否影响生物学功能与治疗价值尚不清楚。igf家族(igfs)由igf-i、igf-ii、igf-ir、igf-iir以及6种结合蛋白组成。igfs与胰岛素有相似的分子结构，它的功能包括促进细胞增殖、分化和各种类型细胞的生存以及保持细胞的各种功能，其在体内生长调控中发挥重要作用。igf-ii的主要功能是产生生长因子，它在许多生长发育过程中起关键作用，并且在生长发育过程中以及成年后都广泛表达。愈来愈多的证据表明igf-i和ii及其酪氨酸激酶受体，参与hcc发生与发展。联合靶向igf-ir和mtor通路作为一种新型治疗方法，将最大限度的发挥抗肿瘤作用，且防止耐药机制早期发展。

介于igf-ir在肝癌形成、恶性转化及侵袭转移过程中都扮演着重要角色，阻断该信号通路，有望使癌细胞生长受抑、诱导癌细胞发生凋亡或增加对放、化疗敏感性，表明酪氨酸激酶受体igf-ir已成为小分子酪氨酸激酶抑制剂、抗体药物设计及核酸干预的重要靶点。

新近一项crispr/cas9基因敲除新技术，突破物种限制可敲除任何基因。crisprrna是原核生物中的调控rna，用以抵御病毒和质粒的入侵，在ii型crispr系统中，其形成的复合物首先特异识别基因组序列，然后cas9核酸内切酶切断目的基因双链。cas9以序列特异性方式绑定和切割dna能力非常强大，近年被广泛应用于各种基因组的研究包括hbv基因。尚未见定向剪接肝癌igf-ir基因的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种特异靶向igf-ir基因的sgrna导向序列。该sgrna导向序列可以用于敲除肝癌细胞中igf-ir基因，使其转录水平明显下降，使肝癌hepg2细胞的生物学特性发生明显改变，表现为癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力下降。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种靶向igf-ir基因的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seqidno:2所示，能识别人肝癌细胞染色体上igf-ir基因，和与cas9核酸酶结合的骨架rna片段。

本发明另一个目的在于提供由编码所述靶向igf-ir基因的sgrna的dna分子。

本发明第三个目的是提供上述sgrna在特异识别和靶向修饰人肝癌细胞igf-ir基因中的应用。所述人肝癌细胞igf-ir基因，其基因组序列是ncbinm000875中的区域。

本发明第四个目的是提供上述sgrna在构建人肝癌细胞igf-ir基因突变库中的应用。所述人肝癌细胞igf-ir基因，其基因组序列是ncbinm000875中的区域。

现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种特异靶向识别igf-ir基因的sgrna，并提供了该sgrna的编码dna片段，应用crispr/cas9-sgrna慢病毒载体系统，在细胞水平上成功对人肝癌细胞igf-ir基因进行敲除或修饰，使肝癌细胞igf-ir基因转录水平明显下降，使肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力下降，为肝癌治疗提供有效新方法，具有临床应用前景。

附图说明

图1为嘌呤霉素筛选经cas9病毒感染的细胞。

图2为二次感染带荧光的sgrna病毒，其中，a：普通光镜图；b：同一视野荧光显微镜图；a&b1-3为sgrna(+)病毒感染组，a&b4为sgrna(-)病毒感染组。

图3为二次感染带荧光的sgrna病毒感染效率直方图；sgrna1-3为sgrna(+)病毒感染组。

图4为蛋白水平验证igf-ir基因敲除效率westernblotting图。

图5为蛋白水平验证igf-ir基因敲除效率quantityone(bio-rad)软件定量条带灰度强度，*：p<0.05。

图6为敲除igf-ir基因抑制肝癌细胞增殖活性影响的线性图，其中，*p<0.01，**p>0.05。

图7为敲除igf-ir基因抑制肝癌细胞增殖活性影响的直方图，其中，*p<0.01，**p>0.05。

图8为肝癌hepg2细胞transwell小室侵袭试验显微镜图，其中：a空白组；b阴性对照组；csgrna2感染组穿膜细胞数明显减少,*p<0.01。

图9为肝癌hepg2细胞transwell小室侵袭试验直方图，sgrna2感染组穿膜细胞数明显减少,*p<0.01。

图10为划痕试验法检测igf-ir在肝癌细胞迁移中的作用显微镜图；其中，a1&a2:空白组，b1&b2:阴性对照，c1&c2:sgrna2干预组。

图11为肝癌hepg2细胞transwell小室纵向迁移试验显微镜图，其中：a空白组；b阴性对照组；csgrna2感染组显示抑制纵向迁移能力,*p<0.01。

图12为肝癌hepg2细胞transwell小室纵向迁移试验直方图，sgrna2感染组穿膜细胞数明显减少,*p<0.01。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

如无特殊说明，本发明以下实施例中选自以下材料，但并非是对本发明技术方案的限定。

1)人肝癌细胞株

人肝癌hepg2细胞株购自中科院上海细胞所，设三组：空白组(untreated组)、阴性组(lv-neg组)和感染组(lv-sgrna-igf-ir组,干扰-1，干扰-2和干扰-3)进行研究。

2)细胞培养相关试剂

dmem培养基购自南京凯基生物科技有限公司；胎牛血清购自以色列bi公司；0.25％胰蛋白酶溶液购自美国invitrogen公司；磷酸盐缓冲盐水(phosphatebufferedsaline,pbs)购自coring有限公司；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,dmso)购自美国sigma公司。

3)慢病毒感染相关试剂

lv-sgrna-igf-ir(pca00469，pca00470，pca00471)，阴性对照病毒sg-rna-con244，lv-cas9-puro(7768-1)，polybrene感染增强剂，enis培养液等购自上海吉凯公司；嘌呤霉素购自北京索莱宝公司。

4)蛋白分析相关试剂

ripa裂解液(强)，苯甲基磺酰氟(pmsf)，bca蛋白浓度测定试剂盒，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)蛋白上样缓冲液等购自北京索莱宝公司；鼠抗人igf-ir抗体、β-actin鼠抗人抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg抗体均购自美国abcam公司；预染蛋白marker购自美国thermo公司旗下fermentas公司；pvdf膜，immobilonecl发光液购自美国millipore公司。

5)细胞增殖相关试剂

cellcountingkit-8assay(cck-8)试剂盒购自日本同仁化学研究所。

6)其他试剂

免疫组化试剂盒，一抗稀释液购自丹麦dako公司。甘氨酸、tris购自美国bio-rad公司；甲醇、三氯醋酸和醋酸等均为国产分析纯以上级产品。

实施例1

(1)hepg2细胞株复苏

采用迅速融化的方式，将人肝癌hepg2细胞株的冻存管从-80℃冰箱取出后，立即放入37℃恒温水浴锅中快速震荡解冻，持续1min。在超净台先用乙醇消毒，后开启。用吸管将hepg2细胞悬液吸至放有九倍体积的完全培养液(简称完培，含有10％胎牛血清的dmem)的离心管内，混匀后用离心机低速离心(1000rpm×5min)，弃去上清液，然后加入5ml完全培养液，并吹打混匀后吸入培养瓶中，置于37℃、5％co2且饱和湿度的培养箱中培养，第二天观察细胞生长情况，并且更换培养液。

(2)hepg2细胞株培养

当细胞融合度大于80％时，弃去原培养液，用pbs洗涤两次，再加入2ml的胰蛋白酶消化液，将培养瓶放置显微镜下观察细胞形态变化，观察到细胞形态变圆、胞质回缩以及细胞间隙增大时弃去胰酶，加入完全培养基吹打重悬细胞，然后将吹打后的细胞悬液分装到三个培养瓶中，继续培养。

(3)hepg2细胞株冻存

遵循“慢冻速融”的原则，取生长状态良好的对数生长期细胞，于冻存前一天进行换液。常规消化收集细胞，加入冻存液(10％dmso+20％胎牛血清+70％dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem)，并调整，最终冻存液中细胞浓度为5～10×10⁶/ml，再分装到无菌的冻存管内。管壁标签上注明细胞的名称、代数和日期，后用封口膜封口。将封好的冻存管先置于4℃冰箱30min，再置于-20℃冰箱90min，最后置于-80℃冰箱长期保存。

(4)细胞计数和细胞活力检测

先用乙醇消毒计数板，然后常规消化收集细胞，并制备单细胞悬液，用枪头取吹打好的细胞悬液10μl滴入计数板上盖玻片一侧，待细胞悬液完全铺开后，在显微镜下计数。细胞计数的方法：用10×物镜观察计数板四个角的大方格中的细胞数，细胞数＝(4大格细胞数之和/4)×10⁴/ml时，台盼蓝可穿透发生损伤或死亡的细胞的变性细胞膜，并且可以与解体的dna结合使其着色，但是活细胞却能阻止台盼蓝进入细胞内，从而鉴别死细胞和活细胞。计算细胞活力＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。当细胞活力达95％以上可以进行慢病毒感染实验。

实施例2

crispr/cas9-sgrna双载体慢病毒构建、感染及筛选

(1)针对igf-ir基因的慢病毒构建

根据人igf-ir序列(ncbi：nm000875)，以crispr/cas9-sgrna技术原理，设计3条sgrna序列：

sgrna-1：5’-tcagtacgccgtttacgtca-3；(干扰-1)

sgrna-2：5’-tgtttccgaaatttaccgca-3’；(干扰-2)

sgrna-3：5’-ggctctctccccgttgttcc-3’；(干扰-3)

并构建质粒载体lenti-cas9-puro和lenti-sgrna-egfp。

(2)目的细胞慢病毒感染与筛选

将未感染慢病毒的肝癌hepg2细胞接种于6孔板中达到70～80％融合度，在细胞贴壁后，在6孔板中分别加入1μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml的嘌呤霉素(puromycin)药物，48h后观察细胞形态，来进行致死最低浓度的筛选，从而得出药物处理48h后hepg2细胞全部死亡的最低药物浓度。

用胰酶将对数生长期的hepg2细胞进行消化，加入完培制成细胞悬液。再将hepg2细胞悬液(细胞数约为5×10⁴)接种于6孔板中，置于37℃5％co2培养箱中培养，当细胞融合度达到30％时，进行换液，然后根据预实验所得的感染条件和细胞感染复数(multiplicityofinfectio,moi＝10)，用枪头吸入适宜量cas9病毒，加入到6孔板中。12h后在显微镜下观察细胞状态：如果细胞状态良好，继续培养24h后更换培养基；如果细胞状态差，出现细胞毒性作用，则立即更换培养基。在48h后，加入嘌呤霉素药物筛选48h，从而得到表达cas9稳定的混合克隆。立即观察筛选后的细胞状态，保证细胞状态良好。hepg2细胞感染cas9-puro病毒48h后加入嘌呤霉素进行筛选，嘌呤霉素经空细胞致死最低浓度筛选之后浓度定为2μg/ml。48h后在光学显微镜下观察，结果如图1，a：感染cas9病毒，b：加入嘌呤霉素48h后；c&d：对照组。a&b组感染cas9病毒的细胞经嘌呤霉素筛选后存活，c&d组未感染的细胞经嘌呤霉素筛选后死亡。

继续培养感染成功的细胞，常规消化后，制成细胞悬液，并且铺板，按照吉凯生物公司慢病毒感染细胞步骤感染表达sgrna的慢病毒。3天后在荧光显微镜下观察慢病毒感染的细胞的荧光效率，荧光效率在80％左右的细胞开始进行后续实验。

收集存活细胞在扩大培养后行二次感染sgrna-egfp病毒，感染48h后在倒置荧光显微镜下观察，成功转染的细胞带绿色荧光(图2a&b)，随机选取五个视野细胞计算感染效率(n＝5)，结果分别为91％，90％，88％和86％(图3)。

实施例3

cck-8法检测细胞增殖

按照cck-8试剂盒提供的说明书操作步骤，设空白对照组，阴性对照组，实验组，取生长状态良好的对数生长期细胞，加入胰蛋白酶进行消化，制备成细胞悬液，再接种于96孔板(n＝3)，每孔约100μl，将96孔板置于培养箱中进行预培养(37℃，5％co2的条件下)，于既定时间点取出并换液，每孔加入10μl的cck-8试剂，继续在培养箱中孵育1-4h后在酶标仪检测a450值。

成功感染慢病毒的细胞收集后提取蛋白进行western检测分析蛋白水平的基因敲除效率(图4，图5)，sgrna2靶点对应的细胞igf-ir蛋白表达量明显降低，与其余四组细胞相比差异具有统计学意义(*p<0.05)；半定量分析hepg2、sgrna-neg、sgrna1和sgrna3的igf-ir灰度强度比值分别为1.22±0.13，1.14±1.23，1.01±0.94，0.99±0.82，而sgrna2比值为0.43±0.79。

实施例4

transwell迁移检测细胞侵袭能力

第一步准备基质胶：将冻存的bdmatrigel置于4度过夜，使其变为液态。

第二步取用24孔bordend小室，孔径为8μm。用dmem冲洗小室，再用50mg/lmartrigel1：8稀释液包被bordend小室底部膜的上室面，室温风干。

第三步分别加入200μl浓度为l×10⁹/ml各组(空白组、阴性组、sgrna-2组-干扰-2)的细胞悬液至于上室.上室液为含10g/lbsa无血清dmem培养基。24孔板下室加入每孔500μl含10％胎牛血清完全培养液。

第四步置于培养箱中培养24h后取出小室.用吸管吸入pbs进行淋洗，再用棉签轻轻擦拭去微孔膜内层的细胞，加入95％酒精固定5min后用4g/l结晶紫染色。

第五步在倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，随机计数五个视野/样本(n＝3)。

细胞侵袭试验显示，与阴性组(160±21)相比，sgrna2感染组(50±12)穿膜细胞数明显减少，差异具有统计学意义(t＝4.682,p<0.01)，空白组(210±16)与阴性组(160±21)相比，未见明显差异(t＝2.082,p＝0.264),说明敲除igf-ir能明显抑制肝癌细胞的侵袭能力(图8，图9)。

实施例5

transwell迁移检测细胞横向迁移能力

划痕愈合：将空白对照组、阴性对照组、sgrna-2组的细胞用胰酶消化后，制成细胞悬液，以每孔8×10⁵个细胞接种于6孔板中；当细胞达到90％融合时，弃去培养基并用pbs洗涤3次，用枪头在培养板底部进行等宽划痕；用pbs冲洗净刮落细胞后，用吸管加入适量无血清培养基继续培养，48h时置于倒置显微镜下，观察细胞的迁移情况并拍照，采用picpic图像分析软件测量划痕两侧细胞的迁移数目。每组设3个复孔(n＝3)。

采用划痕实验法测试敲除igf-ir对细胞横向迁移能力的影响，经倒置相差显微镜计数(图10)，划痕24h后，c2细胞迁移数明显减少，p<0.01。显示c2:sgrna2感染组细胞迁移数(292±28)与阴性组(564士15)间差异显著(t＝14.831,p<0.01),空白对照(580±14)与阴性对照组(564士15)间未见明显差异(t＝1.351,p＝0.102)。

实施例6

transwell迁移检测细胞纵向迁移能力

胰酶消化三组(空白对照组、阴性对照组、sgrna-2组)的细胞，每孔下室加入500μl10％胎牛血清的培养基，transwell上室(上室滤膜无matrigel包被)分别加入200μl浓度为l×10⁹/ml各组(空白对照组、阴性对照组、sgrna-2组)的细胞悬液.上室液为含10g/lbsa无血清培养基，置于培养箱中培养24h后取出小室。用吸管吸入pbs进行淋洗，再用棉签轻轻擦拭去微孔膜内层的细胞，加入95％酒精固定5min后用4g/l结晶紫染色，在倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，随机计数五个视野/样本，并取平均值(n＝3)。

细胞迁移(图11，图12)显示，sgrna2感染组的肝癌hepg2细胞接种上室24h后，穿膜细胞数均明显减少，肝癌hepg2细胞空白组、阴性对照组和sgrna2感染组穿膜细胞数，分别为176±12、155±24和59±19个，感染组与阴性组相比，差异具有统计学意义(t＝5.432,p<0.01),空白组与阴性组相比，未见明显差异(t＝1.355,p＝1.006)，敲除igf-ir能明显抑制hepg2细胞纵向迁移能力。

本发明首次以crispr/cas9双载体慢病毒构建、成功转染肝癌细胞并筛选出有效序列。肝癌hepg2细胞中igf-ir基因被crispr/cas9-sgrna靶向敲除后，癌细胞增殖受抑，以划痕愈合、迁移运动及侵袭试验证明肝癌细胞侵袭、迁移等生物学行为发生变化，提示igf-ir基因可望成为肝癌基因治疗一个有效靶目标。

综上所述，临床上多数肝癌在确诊时已属中、晚期，已不能进行手术切除，放疗或化疗有其局限性，并且预后较差。hcc组织igf-ir表达明显高于癌旁，癌组织igf-ir表达与hcc患者生存期密切相关；肝细胞恶性转化过程中igf-ir介导的信号转导通路异常激活，以酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体、microrna干扰靶向igf-ir已成为肝癌治疗的热点。然而对igf-ir通路作用机制认识有待深入研究，敲除igf-ir可抑制癌细胞增殖、侵袭、迁移，但研发以igf-ir为靶点既安全又有效的基础和临床试验，与手术、介入、化疗或放疗等相结合，将会为肝癌治疗提供有效新方法，具有临床应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>南通大学附属医院;南通大学

<120>一种靶向igf-ir基因的sgrna及其应用

<130>gw2017i1303

<160>3

<170>patentinversion3.5

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