一种抗原多肽及其编码基因和用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗原多肽及其编码基因和用途。

背景技术：

人类乳突病毒(humanpapillomavirus，简称hpv)，属于乳多空病毒科乳头瘤病毒属，是一种小型无包膜的病毒颗粒，呈球形，二十面体对称，直径约45-55nm，病毒的核心为双链dna；病毒衣壳由两种结构蛋白构成的72个壳微粒组成。病毒dna包含约8000碱基对，其中包括8个早期开放读码框架(e1-e8)、2个晚期读码框架(l1和l2)和1个非编码长控区(lcr)。在早期开放读码框架中，e6和e7基因对细胞生长刺激最为重要，单独e7编码的e7蛋白就可以引起宫颈上皮细胞永生化。而晚期读码框l1和l2基因分别编码hpv的主要和次要衣壳蛋白，组装成hpv的衣壳。

最早确定以及最重要的hpv相关肿瘤是宫颈癌，其发病率仅次于乳腺癌，是严重威胁女性健康的杀手。据统计每年世界范围内约有490,000例左右的新发病例，其中约130,000发生在中国，每年约有270,000人死于该疾病，约50,000是中国人。随后，更发现外阴癌、食管癌、乳腺癌甚至肺癌等恶性肿瘤的发生、发展都与hpv感染相关。迄今发现的100多种hpv亚型中，高致癌的hpv亚型(即高危型hpv)有10多种，包括hpv16、18、31、58等。目前认为，hpv感染对宫颈癌的发生是必要但非充分的。据研究显示，99.7％宫颈癌患者存在hpv感染。

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，发病率位于女性肿瘤的第二位，仅排在乳腺癌之后，每年全球大约有50万例新发宫颈癌病例，约20万人死于宫颈癌，在一些发展中国家甚至已居于女性癌症死亡率首位。分子流行病学的研究已经证实人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)感染与宫颈癌有着十分密切的关系。hpv高危型(hpv16，18，31，45型等)的感染是导致宫颈癌发生和发展的重要原因，宫颈癌中hpvdna的检出率高达99％，其中hpv16约为60％。hpv16两个早期基因e6、e7的表达产物e6、e7蛋白在肿瘤发生、细胞周期调控及凋亡调节中起重要作用，是宫颈癌发生的主要原因，在癌细胞中持续表达，也被称为e6、e7癌蛋白。因此e6和e7蛋白可以作为hpv16相关肿瘤治疗性疫苗的理想靶抗原，相继也出现了以e6、e7为免疫抗原不同形式的疫苗。由于蛋白质疫苗既不受人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，hla)限制性，又避免了病毒载体或dna疫苗潜在的安全隐患，是目前公认最安全、有效的疫苗。

现有技术中，尽管基于hpvl1蛋白的宫颈癌预防性疫苗已经商业化，但基于hpv及其e7的治疗性疫苗，尚处于实验研究探索阶段。而存在的问题是：治疗性疫苗发挥作用是建立在机体免疫功能基础之上，用肿瘤特异性抗原或表位激发更为强烈的抗肿瘤特异性免疫效应，以达到清除肿瘤细胞的目的；但肿瘤病人往往存在自身免疫功能低下，或免疫抑制或免疫逃逸等而使治疗性疫苗发挥作用有限，难以达到预期的治疗目的，因此，hpv疫苗用于预防和治疗宫颈癌已成为近年来的研究热点。尽管hpv预防性疫苗已经问世，但是面对众多已感染hpv且出现病变的患者，预防性疫苗作用不大。

与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗具有如下优点：(1)免疫保护力增强。接种后蛋白质在宿主细胞内表达，直接与组织相容性复合物mhci或ii类分子结合，同时引起细胞和体液免疫，对慢性病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病的预防更加有效。(2)2制备简单，省时省力。核酸疫苗作为一种重组质粒，易在工程菌内大量扩增，提纯方法简单，且可将编码不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗，这样可大大减少人力、物力、财力以及多次接种带来的应激反应。(3)同种异株交叉保护。这是基因疫苗的最大优点之一。在制备基因疫苗时，可通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造，从而选择抗原决定簇。(4)应用较安全。接种核酸疫苗后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，无因毒力返祖或残留毒力病毒颗粒而引发疫病的危险，也不会引起对机体的不良反应。(5)产生持久免疫应答。免疫具有持久性，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫。(6)贮存、运输方便。核酸疫苗的质粒dna稳定性好，便于贮存和运输，无须冷藏。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种抗原多肽及其编码基因，提供表达该抗原多肽的表达载体，提供一种宿主细胞，提供该抗原多肽及其编码基因、表达载体和宿主细胞的用途，还在于提供一种疫苗和抗体。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种抗原多肽，所述抗原多肽由以下序列组成：

(1a)如seqidno:2所示的氨基酸序列；或者

(2a)与seqidno:2具有至少80％序列同一性且具有与seqidno:2相同的抗原功能的氨基酸序列。

seqidno:2：

gpagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthv。

优选地，所述抗原多肽与seqidno:2具有至少90％序列同一性且具有与seqidno:2相同的抗原功能的氨基酸序列。

优选地，所述抗原多肽与seqidno:2具有至少95％序列同一性且具有与seqidno:2相同的抗原功能的氨基酸序列。

优选地，所述抗原多肽与seqidno:2具有至少98％序列同一性且具有与seqidno:2相同的抗原功能的氨基酸序列。

优选地，所述抗原多肽与seqidno:2具有至少99％序列同一性且具有与seqidno:2相同的抗原功能的氨基酸序列。

优选地，所述抗原多肽是如权利要求1所述的氨基酸序列经过修饰所得到的具有抗原功能的多肽衍生物。

本发明提供了上述所述的抗原多肽的编码基因。

优选地，所述抗原多肽的编码基因由以下序列组成：

(1b)如seqidno:1所示的核苷酸序列；或者

(2b)具有与seqidno:1至少80％序列同一性且编码具有与seqidno:1相同的抗原功能的核苷酸序列。

seqidno:1：

ggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgta。

优选地，所述抗原多肽的编码基因是具有与seqidno:1至少90％序列同一性且编码具有与seqidno:1相同的抗原功能的核苷酸序列。

优选地，所述抗原多肽的编码基因是具有与seqidno:1至少95％序列同一性且编码具有与seqidno:1相同的抗原功能的核苷酸序列。

优选地，所述抗原多肽的编码基因是具有与seqidno:1至少98％序列同一性且编码具有与seqidno:1相同的抗原功能的核苷酸序列。

优选地，所述抗原多肽的编码基因是具有与seqidno:1至少99％序列同一性且编码具有与seqidno:1相同的抗原功能的核苷酸序列。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体是将上述所述的编码基因连接到基础载体上而得的，用于表达上述所述的抗原多肽。

优选地，所述基础载体为哺乳动物表达载体。

优选地，所述基础载体为pcdna3质粒。

本发明提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有上述所述的表达载体，或其基因组中整合有上述所述的编码基因。

优选地，所述宿主细胞是上述所述的表达载体转化或转染到宿主细胞而得到的。

本发明提供了上述所述表达载体表达的重组抗原多肽，或者培养上述所述的宿主细胞得到的重组抗原多肽。

本发明提供了上述所述的抗原多肽、上述所述的编码基因、上述所述的表达载体、上述所述的宿主细胞、或上述所述的重组抗原多肽在制备预防或治疗肿瘤疾病的疫苗中的用途。

优选地，所述肿瘤疾病为宫颈癌。

本发明还提供了一种预防或治疗肿瘤疾病的疫苗，所述疫苗包括上述所述的抗原多肽、表达载体、或重组抗原多肽。

优选地，所述肿瘤疾病为宫颈癌。

本发明还提供了一种抗体，所述抗体是由上述所述的抗原多肽、或重组抗原多肽制备而成的抗体。

优选地，所述抗体是单克隆抗体或者多克隆抗体。

本发明提供了上述所述的抗体在制备预防或治疗肿瘤疾病的药物中的用途。

优选地，所述肿瘤疾病为宫颈癌。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种抗原多肽及其编码基因，本发明提供的编码基因，能够提高抗原基因的稳定性和免疫原性，其效果相当于完整hpv16e7基因效果的7倍左右。

(2)本发明提供了表达该抗原多肽的表达载体，该表达载体可用于表达本发明提供的抗原多肽，或其重组抗原多肽。

(3)本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞是由上述所述载体的转染与转化所得，使用该宿主细胞可以得到上述所述的抗原多肽或其重组抗原多肽。

(4)本发明还提供了该抗原多肽及其编码基因、表达载体、宿主细胞和重组抗原多肽的用途，可用于制备预防或治疗肿瘤疾病疫苗，特别是宫颈癌。

(5)本发明还提供了一种抗体，运用上述所述的的抗原多肽及其编码基因、表达载体、宿主细胞和重组抗原多肽可以制备得到相应的抗体，可用于预防或治疗肿瘤疾病(特别是宫颈癌)药物的制备，比如单克隆抗体或者多克隆抗体药物。

附图说明

图1为本发明实施例1中p1321hpv16e6e7质粒图谱；

图2为本发明实施例1中哺乳动物的pcdna3载体质粒图谱，图中所示889-983区间，即为插入序列的位置；

图3为本发明实施例1中e7片段进行琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果；

图4为本发明实施例1中hpv16e7目的基因(ce7)重组质粒的构建图如图4所示；

图5为本发明实施例1中hpv16e7完整基因(fe7)重组质粒的构建图；

图6为本发明实施例1中肿瘤小鼠质粒注射的效果图，其中，a组为治疗组(ce7)处理的黑鼠；b组为发病组(fe7)处理的黑鼠；c组为健康组黑鼠；

图7为本发明实施例1中老鼠皮肤he染色的结果图，其中，a为治疗组(ce7)老鼠的皮肤he染色结果；b为发病组(fe7)老鼠的皮肤he染色结果；c为健康组老鼠的皮肤he染色结果；

图8为本发明实施例1中老鼠的pet-ct(正电子发射计算机断层显像)结果；

图9为本发明实施例1中肿瘤重量检测的结果图，其中，a,b组为对照组的结果；c组为fe7免疫的结果；d为ce7免疫组的结果。

具体实施方式

实施例1

一、目的片段的获得

hpv16e7完整序列(seqinno:3)：nc_001526.4

atgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactgatctctactgttatgagcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatgacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccataa。

hpv16e7蛋白序列(seqinno:4)：

mhgdtptlheymldlqpettdlycyeqlndsseeedeiddirtledllmgtlgivcpicsqkp。

从第118个位点到第222个(共105bp)位点(上述hpv16e7完整序列中方框所示区域,即seqinno:1)为我们剪切下来的序列，称为hpve7剪切片段，序列的长度为105bp，其对应的氨基酸为上述hpv16e7蛋白序列中方框所示区域，即seqinno:2，为第40个氨基酸到第74个氨基酸，总计35个氨基酸)。

二、重组质粒的构建

hpve7剪切片段(ce7)和hpve7完整序列(fe7)都是通过pcr(酶联免疫反应)的方法获得的，其模板是p1321hpv16e6e7质粒，如图1所示。pcr扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，e7片段对应条带被切下然后进行纯化。纯化后片段进行限制性内切酶酶切(限制性内切酶的酶切位点为hindiii和xbai，cmv启动子作为对照)，然后将酶切产物插入pcdna3质粒，如图2所示。

fe7的pcr引物:

5'ggcgccaagctt(hindiii)catgcatggagatacacctacat(seqinno:5)，

3'cgggggcgttatggtttctgagaacagatgtctaga(xbai)(seqinno:6)。

ce7的pcr引物：

5'gcgccgccaagctt(hindiii)catgggtccagctggacaagca(seqinno:7),

3'gccggctacgtgtgtgctttgtacgcacaatctaga(xbai)(seqinno:8)。

e7片段进行琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果如图3所示。图3中a就是e7全长片段(fe7)的凝胶电泳图，图3中b就是剪切后的e7片段(ce7)片段的凝胶电泳图。其中m道对应的是dna标记(dnamarker)，1-4道对应的是同时进行的平行实验酶切产物。

(1)hpv16e7目的基因(ce7)重组质粒的构建

hpv16e7目的基因(ce7)重组质粒的构建图如图4所示。

步骤如下

①用限制性内切酶(hindiii和xbai)处理质粒pcdna3。将1μg的pcdna3和2μl10×缓冲液加入ep管中，再加入17μl双蒸水，混匀。将上述溶液和1μl酶液(hindiii和xbai)混合，用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底。然后在37℃水浴保温2-3h，每管加入2μl0.1mol/ledta(ph8.0)终止反应，电泳检测酶切产物。

②用限制性内切酶(hindiii和xbai)处理ce7片段。将1μg的ce7片段和2μl10×缓冲液加入ep管中，再加入17μl双蒸水，混匀。将上述溶液和1μl酶液(hindiii和xbai)混合，用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底。然后在37℃水浴保温2-3h，每管加入2μl0.1mol/ledta(ph8.0)终止反应，电泳检测酶切产物。

③电泳之后切胶，即将含有目的片段(pcdna3和的胶切下ce7片段)，并且用胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

④9ul的双蒸水、3ul的酶切pcdna3、5ul的ce7片段、2ul的10×buffer、1ul的t4连接酶。按照上述顺序依次加入，混匀，16℃的水浴锅，连接过夜。

⑤将产物收集纯化后测序鉴定。测序结果与预期的结果一致，测序的结果证明成功将ce7片段序列插入到质粒pcdna3中，并且插入的ce7片段序列没有问题。

其中质粒：pcdna3:

889:hindiii:5'...a▼agctt...

3'....ttcga▲a

983:xbai:5'...t▼ctaga

3'.....agatc▲t

(2)hpv16e7完整基因(fe7)重组质粒的构建

hpv16e7完整基因(fe7)重组质粒的构建图如图5所示。

①用限制性内切酶(hindiii和xbai)处理质粒pcdna3。将1μg的pcdna3和2μl10×缓冲液加入ep管中，再加入17μl双蒸水，混匀。将上述溶液和1μl酶液(hindiii和xbai)混合，用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底。然后在37℃水浴保温2-3h，每管加入2μl0.1mol/ledta(ph8.0)终止反应，电泳检测酶切产物。

②用限制性内切酶(hindiii和xbai)处理fe7片段。将1μg的fe7片段和2μl10×缓冲液加入ep管中，再加入17μl双蒸水，混匀。将上述溶液和1μl酶液(hindiii和xbai)混合，用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底。然后在37℃水浴保温2-3h，每管加入2μl0.1mol/ledta(ph8.0)终止反应，电泳检测酶切产物。

③电泳之后切胶，即将含有目的片段(pcdna3和的胶切下fe7片段)，并且用胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

④9ul的双蒸水、3ul的酶切pcdna3、5ul的ce7片段、2ul的10×buffer、1ul的t4连接酶。按照上述顺序依次加入，混匀，16℃的水浴锅，连接过夜。

⑤将产物收集纯化后测序鉴定。测序结果与预期的结果一致，测序的结果证明成功将fe7片段序列插入到质粒pcdna3中，并且插入的fe7片段序列没有问题

(4)采用el-4细胞将重组质粒进行扩增

即将感受态的el-4细胞与fe7和ce7质粒混合电转，然后洗脱未被转入的质粒

三、重组质粒的应用

(1)皮肤肿瘤动物模型的构建

即将fe7expressingel-4细胞注射到c57bl6老鼠的皮下，剂量为50μl，1x10⁵个细胞，经过两个月时间肿瘤组织在皮下的生长，即开始后续实验。对照组老鼠(c组)被注射el-4细胞(或者未经过改造的pcdna3载体质粒-空质粒)。

(2)采用ce7和fe7重组质粒分别进行肿瘤治疗实验

首先，在实验第1天，将ce7(a组)和fe7(b组)重组质粒转染el4细胞注射细胞到老鼠皮下，c组注射el-4细胞或空质粒,在第24天观察老鼠皮肤得肿瘤组织情况，并取出老鼠肿瘤组织和进行相关检测。

(2a)背部皮肤直接观察

从图6中可以看出，a组和c组黑鼠的背部皮肤被毛完整，没有肿瘤产生的迹象也没有被毛丢失，而在b组中黑鼠的背部可以看到明显的被毛丢失和肿瘤组织生长存在。

(2b)皮肤组织he染色

从图7中可以看出，c组是对照组老鼠的皮肤，可以看到皮肤的各种结构正常，表皮厚度正常，皮下组织清晰。b组为发病组(fe7)老鼠，表皮层明显增厚，真皮层出现癌变的组织。a组为治疗组(ce7)老鼠，表皮厚度有轻微增加，皮下组织没有明显的癌变情况,组织结构基本类似c组。

(3)采用ce7和fe7重组质粒进行肿瘤预防实验a组c57bl6老鼠仅注射el4细胞，b组c57bl6老鼠注射转染空质粒的el4细胞，c组c57bl6老鼠注射转染携带有fe7基因质粒的el4细胞，d组c57bl6老鼠注射转染携带有ce7基因质粒的el4细胞。第14天，老鼠注射表达e7抗原的tc1肿瘤细胞，剂量为1x10⁶。在第24天，进行pet-ct(正电子发射计算机断层显像)拍照，然后将老鼠解剖，称量肿瘤组织重量。

(3a)老鼠的pet-ct(正电子发射计算机断层显像)结果

a组,b组为阴性对照组，老鼠皮下只注射el4细胞或带空质粒的细胞，c组老鼠先注射插入了fe7的质粒；d为免疫组，注射了插入ce7片段的质粒.

通过图8可以看出，经过ce7片段的质粒免疫过的老鼠(鼠b),其肿瘤组织(块)在大小方面明显要小于老鼠a，同时在亮度方面，老鼠a的亮度是老鼠b的7倍左右，以上说明ce7片段可以显著增加老鼠对tc1癌细胞的免疫能力。

(3b)肿瘤重量的变化:

在实验周期结束后，取出小鼠皮下的tc1肿瘤组织(块)，称量重量。

从图9中可以看出，对于注射了tc1癌细胞的老鼠，其皮下的肿瘤会明显增加，通过a、b两组对比可以发现，试验中使用的质粒不会对肿瘤组织产生明显的影响，但是对过c、d两组对比可以发现，ce7可以明显减少肿瘤组织，达到显著差异的水平。通过以上实验结果，可以得出ce7可以明显阻碍老鼠体内的肿瘤组织生长，实现对肿瘤细胞的免疫作用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。