一种具有微管蛋白识别功能的铱配合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种微管蛋白(tubulin)探针，具体地说是一种具有微管蛋白识别功能的铱配合物及其制备方法和用途。

背景技术：

微管作为所有真核细胞的细胞骨架的主要组成部分，它是由微管蛋白和微管结合蛋白组成，而微管蛋白是由α-微管蛋白和β-微管蛋白连接在一起形成的二聚体。微管蛋白作为一种动态的细胞骨架蛋白，它的装配动态性使其在细胞分裂中具有独特作用。特别是在细胞有丝分裂时期，在中心体的调控下，微管能进一步聚合形成纺锤体，并引导细胞从中期到后期的分化。由于微管网的重组是细胞生命周期和细胞分裂功能的必需过程，所以微管蛋白的含量异常和正常排列、聚合的破坏都与细胞的癌变有关。已报道靶向微管蛋白的荧光探针多为有机小分子化合物，而有机小分子斯托克位移和荧光寿命都较短，易受细胞内自发荧光的影响。因此，设计合成大斯托克位移和长荧光寿命的微管蛋白探针对于进一步探究微管与癌症之间的关系具有重要意义。

近几十年来，金属有机配合物由于其较长的荧光寿命和斯托克位移在活细胞显微成像方面的应用越来越广泛，相继报道了具有特异性靶向的金属有机配合物荧光探针，例如，具有脂质体靶向功能的配合物探针[accountsofchemicalresearch,2015,48,2985]、具有dna靶向[naturechemistry,2009,1,662]和具有bsa靶向功能的配合物探针[chemistry-aeuropeanjournal2009,15,3652]。但到目前为止，靶向微管蛋白的三线态发光铱配合物探针尚未见报道。

申请人对本申请的主题进行了如下的文献检索：

1、xueshu.glgoo.com网检索结果：(2017/07/05)

2、中国知网检索结果：

检索方式一：

篇名-具有微管蛋白识别功能的铱配合物：无相关文献。

篇名-一种具有微管蛋白识别功能的铱配合物及其制备方法：无相关文献。

检索方式二：

全文-具有微管蛋白识别功能的铱配合物：无相关文献。

全文-一种具有微管蛋白识别功能的铱配合物及其制备方法：无相关文献。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种具有微管蛋白识别功能的铱配合物及其制备方法和用途。本发明选择苯并噻唑衍生物作为主配体调节配合物发光，通过引入邻菲罗啉扩大配合物的共轭体系，设计合成了铱配合物ir-tb。研究发现，配合物具有较大的斯托克位移和长的荧光寿命，且目标分子ir-tb能够靶向活细胞内微管蛋白，通过标记微管结构观察细胞有丝分裂不同时期，该化合物在生命科学研究领域具有广阔的应用前景。

苯并噻唑与长春花碱(一种已知的微管蛋白探针)结构相似，可以通过功能化苯并噻唑末端基团，增加化合物与微管蛋白相互作用(氢键、π-π堆积作用等)的结合位点，提高化合物靶向微管蛋白的专一性。

本发明具有微管蛋白识别功能的铱配合物(ir-tb)的结构式为：

本发明具有微管蛋白识别功能的铱配合物的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：中间体m的合成

通n2气保护下，将配体l0.60g(2.2mmol)溶于20ml乙二醇单乙醚和蒸馏水混合溶剂(3:1,v/v)中，待溶解后加入到锡箔纸包裹的100ml史莱克瓶，再加入溶解于10ml水的三水合氯化铱溶液0.33g(1.0mmol)，110℃下回流反应24h；反应结束后冷却至室温，过滤并用少量蒸馏水洗涤沉淀，真空干燥箱中干燥12h，得到橙色固体粉末，即为中间体m。

配体l的合成参照文献方法(bioorganic&medicinalchemistryletters,2011,21(8),2445-2449)。

步骤2：目标产物ir-tb的合成

锡箔纸包裹100ml史莱克反应瓶，通n2气保护下，称取中间体m0.68g(0.50mmol)和邻菲罗啉0.36g(2mmol)溶于50ml二氯甲烷和甲醇混合溶剂(1:1,v/v)中，然后在70℃下反应24h；反应结束后冷却到室温，加入过量六氟磷酸铵0.10g(0.50mmol)，常温搅拌12h，得到红色溶液，加热蒸去大部分溶剂，抽滤，得到红色粗产物1.80g，柱层析分离(洗脱液为二氯甲烷和甲醇按体积比100:1混合得到)后得到橙红色固体0.81g，即为目标产物ir-tb,收率76.20％。

本发明铱配合物的合成路线如下：

本发明具有微管蛋白识别功能的铱配合物的用途，是作为识别活细胞内微管蛋白的荧光探针的应用。

本发明ir-tb的生物学研究如下：

将肝癌细胞(hepg2)种在激光共聚焦小皿上，每个孔接种10⁴个细胞，用1.5ml的培养基培养24-36h。ir-tb配成10^-3m的母液，向培养基中加入15μl的ir-tb母液，在细胞培养箱中染色30min，用pbs洗三遍，可直接用于显影。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明ir-tb的原料廉价易得，合成简单高效，使其商业化成为可能。

2、本发明ir-tb的毒性低(图2)，具有良好的生物相容性，便于应用于生物体。

3、本发明ir-tb可特异性识别细胞内的微管蛋白(图4)，ir-tb与tubulin-免疫荧光蛋白(tb-ab)在细胞内共定位效果好，皮尔森系数可达到89.72％。

4、本发明ir-tb能通过标记微管蛋白，观察细胞不同有丝分裂时期纺锤丝、纺锤体的结构变化，从而判断细胞的分裂时期(图5)。

5、本发明ir-tb不仅可以作为靶向活细胞微管蛋白探针，还能够用于组织显影(图6)。不存在类似可利用的商业生物荧光探针，具有较高的商业价值。

附图说明

图1是ir-tb的单晶椭球图(略去阴离子和h原子)，表明合成的铱配合物是尚未见报道且结构明确的新物质。

图2是不同浓度下的配合物ir-tb与肝癌细胞培养24h后的细胞毒性测试，说明ir-tb的细胞毒性低，具有良好的生物相容性。

图3(a)是本发明ir-tb、商染dapi和tubulin-免疫荧光蛋白tb-ab在活细胞内的共定位显影图，从图中可以看出ir-tb与tb-ab的染色重合率较高，而ir-tb与细胞核染料dapi的染色重合率较低；(b)是ir-tb与tubulin-免疫荧光蛋白tb-ab共定位相关系数图，皮尔森系数高达0.8972，说明ir-tb能够靶向活细胞内的微管蛋白。

图4是利用细胞在不同分裂期，观察ir-tb和核商染在各个分裂期的染色情况：(a)前期、(b)前中期、(c)中期、(d)末期。说明ir-tb能够作为标记纺锤体和纺锤丝内微管蛋白的特征探针，可用于观察处于有丝分裂各个时期的细胞。

图5是本发明ir-tb、商染dapi和tubulin-免疫荧光蛋白tb-ab在活体肾脏组织内的共定位显影图，说明ir-tb不仅可以作为细胞靶向微管蛋白探针，还能够用于组织显影。

具体实施方式

本发明具有微管蛋白识别功能的铱配合物(ir-tb)的结构式为：

本发明具有微管蛋白识别功能的铱配合物的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：中间体m的合成

通n2气保护下，将配体l0.60g(2.2mmol)溶于20ml乙二醇单乙醚和蒸馏水混合溶剂(3:1,v/v)中，待溶解后加入到锡箔纸包裹的100ml史莱克瓶，再加入溶解于10ml水的三水合氯化铱溶液0.33g(1.0mmol)，110℃下回流反应24h；反应结束后冷却至室温，过滤并用少量蒸馏水洗涤沉淀，真空干燥箱中干燥12h，得到橙色固体粉末，即为中间体m。

配体l的合成参照文献方法(bioorganic&medicinalchemistryletters,2011,21(8),2445-2449)。

步骤2：目标产物ir-tb的合成

锡箔纸包裹100ml史莱克反应瓶，通n2气保护下，称取中间体m0.68g(0.50mmol)和邻菲罗啉0.36g(2mmol)溶于50ml二氯甲烷和甲醇混合溶剂(1:1,v/v)中，然后在70℃下反应24h；反应结束后冷却到室温，加入过量六氟磷酸铵0.10g(0.50mmol)，常温搅拌12h，得到红色溶液，加热蒸去大部分溶剂，抽滤，得到红色粗产物1.80g，柱层析分离(洗脱液为二氯甲烷和甲醇按体积比100:1混合得到)后得到橙红色固体0.81g，即为目标产物ir-tb,收率76.20％。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ(ppm):9.52(s,2h),8.92(d,j＝8.3hz,2h),8.49(d,j＝5.1hz,2h),8.32(s,2h),8.14(dd,j＝8.2,5.1hz,2h),8.04(d,j＝8.1hz,2h),7.52(s,2h),7.17(t,j＝7.7hz,2h),6.82(t,j＝7.9hz,2h),5.89(s,2h),5.60(d,j＝8.4hz,2h),4.17(m,4h),1.36(t,j＝6.9hz,6h)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):180.41,151.34,151.15,148.78,146.92,144.43,143.71,139.16,130.60,130.50,130.19,128.26,127.30,124.68,124.01,119.37,115.42,111.98,64.24,14.83；ir(kbr,cm^-1):3053.63(w),2359.43(w),2341.56(w),1602.77(s),1519.55(s),1480.79(s),1434.58(s),1408.33(m),1314.93(m),1227.40(s),1155.98(s),1097.13(m),967.47(s),835.99(s),807.76(m),755.37(s),728.819(s),696.45(m),622.35(s),550.68(m),522.19(m),498.99(m)；esi-ms:cal.913.13,found913.33.

本发明铱配合物的合成路线如下：

本发明ir-tb的生物学研究如下：

将肝癌细胞(hepg2)种在激光共聚焦小皿上，每个孔接种10⁴个细胞，用1.5ml的培养基培养24-36h。ir-tb配成10^-3m的母液，向培养基中加入15μl的ir-tb母液，在细胞培养箱中染色30min，用pbs洗三遍，可直接用于显影。