本发明涉及医药技术领域，具体涉及硫杂吴茱萸次碱化合物及其药用盐，以及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
肿瘤是机体在致瘤因子作用下局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。肿瘤可分为两类，分别是良性肿瘤和恶性肿瘤，对机体伤害较大的称为恶性肿瘤，而癌症即为恶性肿瘤的总称。恶性肿瘤是一种对人类健康和生命有严重威胁的常见病和多发病，占据城市死因的第一位，农村死因的第二名。由于周边环境、生活习惯、遗传因素等多种方面的影响，癌症患者的数量每年都有上升。化疗等常用治疗肿瘤的手段虽然能够一定程度上延长患者的生命，但是由于化疗药物自身的特性，在杀灭肿瘤细胞的同时会对人体正常细胞产生相当巨大的杀伤性，使得患者机体产生不可避免的损伤，可能导致免疫缺陷，出现各种并发症；正常细胞的死亡，使患者的生存质量下降，如头发掉落等问题。因此研究开发高效低毒的抗肿瘤药物已经成为当下关注热点。
天然产物一直是一个重要的药物来源，有报道称，目前有50％以上的抗肿瘤药物是来自于天然产物或其衍生物。天然产物来自动植物、海洋生物和内源性物质等，其中植物是主要来源。寻找天然抗肿瘤活性成分是抗癌药物研究的一个重要途径,然而天然产物因为其结构相对复杂、分子量较大等原因导致其药代动力学性质不佳，影响其药效的发挥以及后续的开发利用。因此，需要对这些活性物质进行结构上的修饰改造或通过生物方法进行筛选等手段，改善它的稳定性、溶解性、细胞渗透性不足等问题。紫杉醇、鬼臼毒素、白芦藜醇等是20世纪发现的具有代表性的天然抗肿瘤活性成分，以它们为基础进行进一步的结构上的修饰和优化，能够得到更多高效且低毒的抗肿瘤药物。
中药吴茱萸（tetradiumruticarpum）是植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实，最早载于《神农本草经》，被列为中品，它具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻等重要功能。吴茱萸中化学成分种类繁多，其中生物碱是其主要成分。长期研究发现，吴茱萸生物碱具有多种生物活性，其中代表性生物碱为吴茱萸碱和吴茱萸次碱。吴茱萸碱能够对心血管疾病、抗炎镇痛、体外抗菌等方面起作用；吴茱萸次碱有抗炎镇痛、抗血栓抑制血小板、抗过敏和免疫抑制、提高耐缺氧能力、抗肿瘤等作用。吴茱萸生物碱的抗肿瘤活性是它的重要药理作用，其抗瘤谱较广，主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡、阻遏细胞周期、抑制肿瘤组织转移和侵袭来起到作用。吴茱萸碱可以抑制细胞增殖来促进细胞凋亡和抑制癌细胞的转移，它还可以抑制微管蛋白的多聚化和纺锤体的形成。
目前，已经有许多吴茱萸碱衍生物被合成，国内第二军医大学张万年、盛春泉等研究发现，吴茱萸碱衍生物对拓扑异构酶ⅰ具有显著抑制活性，抗瘤谱广，但吴茱萸碱衍生物存在选择性不佳的情况，对正常细胞的毒性不容忽视。目前对吴茱萸次碱及其衍生物抗肿瘤活性的研究较少，高抗肿瘤活性、低毒的衍生物仍然是研究的热点，本发明在前期研究的基础上，得到了一类具有较强抗肿瘤活性、毒性较低的硫杂吴茱萸次碱化合物。
技术实现要素：
本发明的目的在于通过对吴茱萸次碱的结构修饰，获得一类具有较强抗肿瘤活性、低毒的硫杂吴茱萸次碱化合物，并提供其制备方法及该类化合物在抗肿瘤药物中的应用。
本发明中所涉及的硫杂吴茱萸次碱化合物，见通式（ⅰ）。
其中，ⅰa:r=-(ch2)3ch3，ⅰb:r=-ch2ch(ch3)2，ⅰc:r=-ch2c6h5，ⅰd:r=-ch2(p-ch3c6h5)。
硫杂吴茱萸次碱化合物可以根据常用方法获得其药用盐的形式，包括无机酸盐或有机酸盐，无机酸包括：盐酸、磷酸、硫酸、氢溴酸或硝酸；有机酸包括乙酸、乳酸、水杨酸或草酸。
本发明中所述硫杂吴茱萸次碱化合物的合成流程如下：
其中，ⅰa:r=-(ch2)3ch3，ⅰb:r=-ch2ch(ch3)2，ⅰc:r=-ch2c6h5，ⅰd:r=-ch2(p-ch3c6h5)。
本发明中所述硫杂吴茱萸次碱化合物的具体合成步骤为：
化合物2的合成：
在配有温度计和冷凝管的三口烧瓶中，加入吴茱萸次碱和劳森试剂，甲苯为反应溶剂，110℃下搅拌反应6h，反应结束后旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得到产物。
化合物（ⅰ）的合成：
在配有温度计和冷凝管的三口烧瓶中，加入硫代吴茱萸次碱，nah，dmf，室温下搅拌20min，缓慢加入卤代烃。50℃下搅拌反应，反应结束后加水淬灭反应，以乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤两次，无水na2so4干燥，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得到产物。
本发明选用mtt法对所合成的化合物进行体外活性测试，以紫杉醇为阳性对照药。活性测试表明，本发明所合成的化合物对3种肿瘤细胞（人结肠癌细胞lovo、人卵巢癌细胞a2780细胞和人乳腺癌细胞mda-mb-231）具有中等以上的抗增殖活性，其ic50值最低为5.89μmol/l。
进一步测试了所合成的化合物对人体正常细胞——人肺成纤维细胞（hfl1）进行细胞毒性测试的体外实验，结果表明，此类化合物对人肺成纤维细胞毒性很小。
本发明化合物的活性测试使其可以用于制备抗肿瘤药物。
本发明的有益效果：该类硫杂吴茱萸次碱化合物对多种肿瘤细胞具有良好的活性，但其对正常人体细胞的毒性很小。
四具体实施方式：
下面结合实施例和数据对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：化合物2（硫代吴茱萸次碱）的合成
在配有温度计和冷凝管的三口烧瓶中，加入吴茱萸次碱（0.50g，3.50mmol），劳森试剂（2.12g，5.25mmol），甲苯（100ml），于110℃下搅拌反应6h，薄层色谱（tlc），展开剂为石油醚（pe）:乙酸乙酯（etoac）=5:1）监测反应。反应结束后旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析（洗脱条件pe:etoac=2:1）分离纯化得到产物。产物为黄色结晶,0.29g,收率:54.5%,产物纯度:99.9%;m.p.216-218℃,tlc展开剂:pe:etoac=5:1,产物rf值为0.52,硅胶柱层析分离纯化,洗脱条件pe:etoac=2:1;ft-ir:3445(νc-h,ar-h),3051(υc-h,ch3),2920(υc-h,ch2),2898(υc-h,ch),1617(υc=o,n-c=o),1595(υc=c),1471(δc-h,ch2),1317(δc-h,ch3),765(δc-h,ar-h);1hnmr(cdcl3,500mhz)δ:3.27~3.32(2h,t,j=6.90hz,nch2ch2),5.18~5.22(2h,t,j=6.87hz,nch2ch2),7.16~7.19(1h,m,arh),7.31~7.34(1h,t,j=7.45hz,arh),7.40~7.44(3h,m,arh),7.68~7.71(1h,t,j=6.95hz,arh),9.24(1h,s,nh);13cnmr(cdcl3,75mhz)δ:19.90,49.14,112.14,120.26,120.80,125.42,125.92,127.18,127.52,128.9,129.08,131.98,134.58,138.62,188.82;hrms:c18h15n3s[m+h]+理论值:304.0830,实际值:304.0864。
实施例2：化合物ⅰa的合成
在配有温度计和冷凝管的三口烧瓶中，加入硫代吴茱萸次碱（0.20g，0.66mmol），nah（20.59mg，0.86mmol），dmf（10ml，4å分子筛除水），室温下搅拌20min，缓慢加入卤代烃（0.99mmol）。50℃下搅拌反应，tlc监测反应。反应结束后进行后处理：加水（10ml）淬灭反应，以乙酸乙酯萃取（20ml）三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤两次，无水na2so4干燥2h，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得到产物。黄色结晶,0.20g,收率:87.6%,产物纯度:99.9%;m.p.163-165℃;tlc展开剂为pe:etoac=1:1，产物rf值为0.24，硅胶柱层析分离纯化，洗脱条件pe:etoac=2:1;ft-ir:3063(υc-h,ar-h),1742(υc=o,n-c=o),1659(υc=c),1500(δc-h,ch2),1404(δc-h,ch3),743(δc-h,ar-h);1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:0.97~1.02(3h,t,j=7.38hz,ch2ch3),1.29~1.26(2h,m,ch2ch3),1.85~1.95(2h,m,ch2ch2ch3),3.21~3.26（2h,t,j=6.66hz,nch2ch2),4.81~4.86(2h,t,j=7.65hz,nch2ch2),5.18~5.22(2h,t,j=6.72hz,nch2ch2),7.16~7.25(1h,t,j=6.93hz,arh),7.35~7.48(3h,m,arh),7.63~7.67(2h,d,j=8.34hz,arh),7.70~7.76(1h,m,arh),8.22~8.85(1h,q,arh);13cnmr(cdcl3,75mhz)δ：13.97,19.87,20.31,32.54,45.09,49.11,110.59,119.56,120.16,123.86,124.73,125.39,126.60,127.51,127.71,128.43,131.93,134.36,140.30,142.32,144.60,188.91;hrms:c22h22n3s[m+h]+理论值:360.1456,实际值:360.1490。
实施例3：化合物ⅰb的合成
在配有温度计和冷凝管的三口烧瓶中，加入硫代吴茱萸次碱（0.20g，0.66mmol），nah（20.59mg，0.86mmol），dmf（10ml，4å分子筛除水），室温下搅拌20min，缓慢加入卤代烃（0.99mmol）。50℃下搅拌反应，tlc监测反应。反应结束后进行后处理：加水（10ml）淬灭反应，以乙酸乙酯萃取（20ml）三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤两次，无水na2so4干燥2h，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得到产物。黄色结晶,0.18g,收率:78.8%,产物纯度:98.5%;m.p.176-178℃;tlc展开剂为pe:etoac=5:1,产物rf值为0.45,硅胶柱层析,洗脱条件:pe:etoac=20:1;ft-ir:3138(υc-h,ar-h),2959(υc-h,ch3),2925(υc-h,ch2),2867(υc-h,ch),1735(υc=o,n-c=o),1588(υc=c),1538(δc-h,ch2),1397(δc-h,ch3),736(δc-h,ar-h);1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:0.94~0.96(6h,d,j=6.72hz,ch3ch2),2.33~2.42(1h,m,ch2chch2),3.23~3.28(2h,t,j=6.63hz,nch2ch2),4.68~4.70(2h,d,j=6.62hz,nch2ch2),5.19~5.23(2h,t,j=6.60hz,nch2ch2),7.15~7.20(1h,t,j=7.71hz,arh),7.33~7.38(1h,t,j=6.78hz,arh),7.43~7.49(2h,t,j=8.19hz,arh),7.63~7.66(2h,d,j=10.14hz,arh),8.82~8.85(1h,m,arh);13cnmr(cdcl3,75mhz)δ:19.84,20.24,30.13,49.18,52.23,111.13,119.77,120.06,120.27,123.73,125.32,126.77,127.52,127.68,128.43,131.95,134.37,140.86,142.20,144.75,188.92;hrms:c22h22n3s[m+h]+理论值:360.1456,实际值:360.1490。
实施例4：化合物ⅰc的合成
在配有温度计和冷凝管的三口烧瓶中，加入硫代吴茱萸次碱（0.20g，0.66mmol），nah（20.59mg，0.86mmol），dmf（10ml，4å分子筛除水），室温下搅拌20min，缓慢加入卤代烃（0.99mmol）。50℃下搅拌反应，tlc监测反应。反应结束后进行后处理：加水（10ml）淬灭反应，以乙酸乙酯萃取（20ml）三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤两次，无水na2so4干燥2h，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得到产物。黄色粘稠固体,0.17g,收率:64.1%,纯度:99.9%;tlc展开剂为pe:etoac=5:1,产物rf值为0.52,硅胶柱层析,洗脱条件pe:etoac=30:1;ft-ir:2963(υc-h,ar-h),2920(υc-h,ch3),2853(υc-h,ch2),1590(υc=o,n-c=o),1468(δc-h,ch2),797(δc-h,ar-h);1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:3.26-3.30(2h,t,j=6.69hz,nch2ch2),5.19~5.23(2h,t,j=6.81hz,nch2ch2),6.16(2,s,phch2n),7.15~7.25(6h,m,arh),7.35~7.45(4h,m,arh),7.52~7.55(2h,d,arh),8.79~8.81(1h,d,arh);13cnmr(cdcl3,125mhz)δ:25.90,48.55,48.99,110.59,119.56,120.16,120.33,123.86,124.73,125.39,126.60,127.51,127.71,128.43,131.93,134.36,140.30,142.32,144.60,188.89;hrms:c25h20n3s[m+h]+理论值:394.1300,实际值:394.1333.
实施例5：化合物ⅰd的合成
在配有温度计和冷凝管的三口烧瓶中，加入硫代吴茱萸次碱（0.20g，0.66mmol），nah（20.59mg，0.86mmol），dmf（10ml，4å分子筛除水），室温下搅拌20min，缓慢加入卤代烃（0.99mmol）。50℃下搅拌反应，tlc监测反应。反应结束后进行后处理：加水（10ml）淬灭反应，以乙酸乙酯萃取（20ml）三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤两次，无水na2so4干燥2h，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得到产物。黄色晶体,0.22g,收率:82.1%,纯度:99.9%;m.p.208-210℃;tlc展开剂为pe:etoac=5:1,产物rf值为0.21,硅胶柱层析纯化,洗脱条件pe:etoac=25:1;ft-ir:2963(υc-h,ar-h),1589(υc=o,n-c=o),1560(υc=c),1458(δc-h,ch2),1458(δc-h,ch3);1hnmr(cdcl3,500mhz)δ:2.25(3h,s,arch3),3.25~3.28(2h,s,j=6.70hz,nch2ch2),5.20(2h,s,nch2ch2),6.12(2h,s,nch2ar),7.02~7.07(4h,q,j=8.15hz,arh),7.17~7.20(1h,t,arh),7.25~7.35(1h,m,arh),7.40~7.55(2h,m,arh),7.57~7.65(1h,m,arh),7.66~7.69(2h,m,arh),8.79(1h,s,arh);13cnmr(cdcl3,75mhz)δ:19.94,21.01,48.30,49.03,111.07,120.20,120.26,120.71,124.13,125.79,126.64,126,74,127.56,128.50,129.23,131.89,134.34,135.63,136.75,140.93,142.17,144.54,188.93;hrms:c26h22n3s[m+h]+理论值:408.1456,实际值:408.1490。
实施例6：硫杂吴茱萸次碱化合物的体外抗肿瘤活性
本发明选用mtt法对所合成的化合物进行体外活性测试，以紫杉醇为阳性对照药。3种肿瘤细胞分别为人结肠癌细胞lovo、人卵巢癌细胞a2780细胞和人乳腺癌细胞mda-mb-231）。将对数生长期的两种肿瘤细胞接种于96孔培养板上，密度为每孔100μl含有细胞5000个，培养过夜，次日用浓度为100μg/ml的待测样品进行处理，在温度为37℃、含有5%co2的培养箱中孵育。72h后，向各孔中加入10μlmtt（5mg/ml，pbs），继续在培养箱中孵育，4h后，每孔加入100μldmso，振摇5min，用酶标仪在波长570nm的条件下测定每孔的吸光值并计算细胞生长抑制率。抑制率（%）=（a对照组-a用药组）/(a对照组-a调零孔)×100。阳性对照为紫杉醇，浓度为0.1mmol/l。选择100μg/ml时对细胞抑制率大于60%的样品，设置5个浓度梯度：200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml，同上法检测吸光度。采用改良寇氏法计算ic50值，计算公式为：ic50=lg-1[xm-i(∑p-0.5)]。式中xm：设计的最大的浓度的对数值；i：相邻两组浓度对数值；∑p：各组生长抑制率之和；0.5：经验常数。
测试结果表明，对人结肠癌细胞lovo来说，化合物ⅰa抑制效果最好，ic50值为16.91μmol/l；对人卵巢癌细胞a2780来说，化合物ⅰb抑制效果最好，ic50值为5.89μmol/l，其次为ⅰa（ic50值为10.23μmol/l）和ⅰd（ic50值为10.51μmol/l）；对人乳腺癌细胞mda-mb-231来说，ⅰa抑制效果最好，ic50值为9.58μmol/l。
实施例7：硫杂吴茱萸次碱化合物的对正常细胞的细胞毒性
对所合成的吴茱萸次碱衍生物采用mtt法对人体正常细胞（hfl1）进行细胞毒性测试的体外实验。将人体正常细胞（hfl1）接种于96孔培养板上，密度为每孔100μl含有细胞5000个，培养过夜，次日用浓度为100μg/ml的待测样品进行处理，在温度为37℃、含有5%co2的培养箱中孵育。72h后，向各孔中加入10μlmtt（5mg/ml，pbs），继续在培养箱中孵育，4h后，每孔加入100μldmso，振摇5min，用酶标仪在波长570nm的条件下测定每孔的吸光值并计算细胞生长抑制率。抑制率（%）=（a对照组-a用药组）/（a对照组-a调零孔）×100。阳性对照为紫杉醇，浓度为0.1mmol/l。选择100μg/ml时对细胞抑制率大于60%的样品，设置5个浓度梯度：20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml，同上法检测吸光度。采用改良寇氏法计算ic50值，计算公式为：
研究所合成的吴茱萸次碱衍生物对人体正常细胞（hfl1）的细胞毒活性，发现所测得ic50值均大于80μmol/l，所合成的化合物对正常细胞几乎没有毒性。