改善老年大鼠骨髓间充质干细胞衰老状态的方法与流程

(一)技术领域

本发明涉及一种改善老年大鼠骨髓间充质干细胞年龄相关的衰老状态的方法。

(二)

背景技术：

缺血性心肌病是严重威胁人类健康的杀手之一，猝死发生率高。大多数患者尽管接受了积极的治疗，仍不可避免的发展为心力衰竭。传统治疗手段虽大大提高了患者的生存率并改善了预后，但并不能挽救濒死的心肌，未能明显改善患者心肌梗死后的心脏重塑。骨髓间充质干细胞因其具有自我更新及多向分化能力，近年来在再生医学领域引起广泛关注和研究。大量的临床研究已经证实其在心血管病治疗上的安全性和有效性，然而骨髓间充质干细胞移植后的低生存率、低定植率成为制约其疗效的关键因素。与此同时，缺血性心肌病主要发生于老年人，而自体骨髓间充质干细胞是仍是用于移植的主要细胞来源，因而年龄因素是否影响其疗效也成为不可回避的问题。事实上，已有大量的研究证实，老年个体来源的骨髓间充质干细胞其生物学性状诸如增值能力、分化能力、抗应激能力均有明显下降，用于移植治疗的效果也较年轻个体来源的细胞明显减弱。到目前为止，虽有多种方法提高骨髓来源的间充质干细胞移植后的生存率，但针对老年个体来源的骨髓间充质干细胞改善其生存率和疗效的研究尚未见报道。

老年个体干细胞功能下降主要由于细胞衰老所致，在导致年龄相关的干细胞衰老的机制中，dna损伤的积累和端粒缩短是重要因素。干细胞是分裂增殖旺盛的细胞，细胞内dna合成代谢过程中发生dna损伤和端粒缩短明显增加，尽管干细胞表达端粒酶活性，但这并不足以弥补细胞分裂所引起的端粒缩短。在老年个体中dna损伤反应是持续存在的，并导致细胞周期停滞和衰老，而这种持续存在的dna损伤反应与端粒及其结合蛋白(shelterin)密切相关。端粒作为染色体dna末端的脱氧核苷酸重复序列，并不是孤立和游离的，而是结合了被称为shelterin的端粒结合蛋白复合体，并构成t环和d环结构。shelterin由六种成分按秩序构成复合体:trf1\trf2\rap1\tin2\tpp1\pot1，在端粒合成、端粒空间结构的形成和维持、保护端粒免受损伤以及不必要的修复反应上发挥重要作用。

tpp1是端粒结合蛋白复合体的重要组成成分，对端粒长度调节和端粒保护发挥重要作用。一方面，tpp1与pot1构成异二聚体从而发挥募集端粒酶到端粒部位以及维持端粒酶活性的作用。另一方面，作为端粒结合蛋白的成分，tpp1与其他成分协同作用，发挥保护端粒部位免受dna损伤，以及通过抑制dna损伤反应通路如atm、atr、p53、γ-h2ax等影响dna损伤修复，并影响细胞周期调控相关的蛋白p16、p21等，而细胞周期调控是细胞衰老的关键机制。我们的前期研究也证明tpp1是介导sirt1改善老年大鼠骨髓间充质干细胞衰老状态和提高细胞移植用于心肌梗死治疗效果的关键分子。这些结果提示通过基因工程方法调节tpp1表达而改善老年来源骨髓间充质干细胞治疗效果的可能性。

(三)

技术实现要素：

本发明目的即是提供一种改善老年大鼠骨髓间充质干细胞年龄相关的衰老状态的方法，旨在提高其移植后对于缺血性心肌病的治疗效果。

本发明采用的技术方案是：

一种改善老年大鼠骨髓间充质干细胞年龄相关的衰老状态的方法，所述方法包括：将老年大鼠来源的骨髓间充质干细胞经体外培养获得的传代稳定的继代细胞，感染tpp1过表达的慢病毒颗粒，获得处理后的骨髓间充质干细胞用于移植。

所述病毒感染条件为：感染体系中加入8ug/ml的polybrene，感染所需moi(multiplicitiesofinfection，即感染一个细胞所需要的病毒颗粒数)为100。

所述tpp1过表达的慢病毒颗粒由汉恒生物科技(上海)有限公司购买所得。

具体的，所述体外培养在co2体积浓度5％、空气体积浓度95％的混合气体中、37℃条件下进行，培养基为含10％胎牛血清的低糖dmem。

所述继代细胞优选为继代第3代细胞。

所述老年大鼠，是指18月龄以上的sd大鼠。

本申请发明人发现，过表达tpp1的老年大鼠骨髓间充质干细胞在体外常规培养条件下其衰老相关的β半乳糖苷酶染色阳性率降低。此外tpp1过表达的老年大鼠骨髓间充质干细胞其衰老相关蛋白p16和p21表达有显著降低。

本发明的有益效果主要体现在：通过感染tpp1过表达慢病毒颗粒实现细胞内tpp1的过表达，可明显改善老年大鼠骨髓间充质干细胞年龄相关衰老，进而改善其治疗缺血性心肌病的效果。

(四)附图说明

图1为tpp1过表达明显改善老年人来源骨髓间充质干细胞的衰老状态。图(i)和图(ii)为半乳糖苷酶染色图像，图(iii)为半乳糖苷酶阳性细胞比率。vector-^oldmscs代表空载体对照组，tpp1-^0ldmscs代表tpp1过表达组。

图2为tpp1过表达明显下调老年人来源骨髓间充质干细胞的衰老相关蛋白p16,p21转录水平。vector-^oldmscs代表空载体对照组，tpp1-^0ldmscs代表tpp1过表达组。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.获取老年大鼠骨髓间充质干细胞。

将18月龄的老年sd大鼠断颈处死，75％酒精消毒皮毛，取出双侧股骨和胫骨，剔除骨表面的软组织和骨垢端，放入装有低糖dmem培养基的离心管中。以下操作除离心外均在超净台进行。将骨组织倒入无菌玻璃培养皿中。眼科剪剪开股骨和胫骨两端少许，暴露骨髓腔。用5ml注射器抽取细胞培养液(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的低糖dmem)反复冲洗骨髓腔；收集冲洗液于50ml无菌离心管中。4℃，1000转/分钟，离心8分钟。丢弃上清液，用培养液重悬细胞。每只大鼠所获细胞接种于两个10cm培养皿，在37℃，含有5％co2，饱和湿度的恒温co2培养箱中培养。静置24小时后首次换液，以去除不贴壁细胞。之后每3-4天换液一次，长满80％～90％以上传代。

2.以含10％(v/v)胎牛血清低糖dmem培养基进行原代和传代细胞培养，放置于37℃、饱和湿度的含5％co2的混合气体(空气95％，v/v)中培养，根据骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性，每4～5天更换细胞培养基，去除非贴壁细胞，不断纯化大鼠骨髓间充质干细胞。继代第3代时细胞可进行形态学、流式细胞学等细胞鉴定。

5.将正常氧浓度下培养的继代第3代大鼠骨髓间充质干细胞用来感染tpp1慢病毒颗粒(由汉恒生物科技(上海)有限公司购买所得)，感染所需的moi为100，感染体系(含10％(v/v)胎牛血清低糖dmem培养基)中加入8μg/ml的polybrene。24h后更换为新鲜的正常培养液(含10％(v/v)胎牛血清低糖dmem培养基)。3日后加入5μg/ml的puromycin筛选7天。筛选结束后，获得的骨髓间充质干细胞用于移植。

6.应用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测大鼠骨髓间充质干细胞的sa-β-gal活性:

对铺至六孔板内的大鼠骨髓间充质干细胞进行步骤5的处理(以感染vector的细胞作为对照)，结束筛选后吸除细胞培养液，pbs洗涤1次，每孔加入β-半乳糖苷酶染色固定液1ml，室温固定15分钟。吸除细胞固定液，用pbs洗涤细胞3次，每次3分钟。吸除pbs，每孔加入1ml染色工作液(1ml配方：a液10μl，b液10μl，c液930μl，x-gal50μl)。保鲜膜封闭，37℃生化培养箱孵育过夜。吸除染色液，每孔加入2mlpbs，普通光学显微镜下观察并拍照。衰老的细胞染色为蓝色(记为阳性)，计算染色阳性的细胞占总细胞的百分比，结果如图1所示。

结果显示tpp1过表达的老年大鼠骨髓间充质干细胞sa-β-gal阳性细胞数目和染色强度均明显减少，表明tpp1能改善老年人骨髓间充质干细胞的衰老状态。

7.实时荧光定量pcr法检测细胞内衰老相关蛋白p16、p21的表达水平:

对步骤5处理的大鼠骨髓间充质干细胞收集的细胞(以感染vector的细胞作为对照)，用trizol法(购自美国lifetechnologies公司)提取rna。用mmlv逆转录试剂盒(购自日本takara公司)将rna逆转录为cdna，用于定量pcr反应。

所用引物为：

大鼠p16基因:上游引物5’-tcgtgcggtatttgcggtat-3’，下游引物5’-ctagtctcgcgttgccagaa-3’；

大鼠p21基因:上游引物5′-tgtgatatgtaccagccacag-3′,下游引物5′-cgtctcagtggcgaagtcaa-3’。

大鼠β-actin基因:上游引物5′-ccgcgagtacaaccttcttg-3′,下游引物5′-tgacccatacccaccatcac-3’。

反应条件为：95℃预热15秒，继之95℃变性5秒，60℃退火31秒，72℃延伸3秒，进行40个循环。

基因的表达丰度用△△ct法分析。实验结果见图2，结果显示和对照组相比，tpp1过表达能下调老年大鼠骨髓间充质干细胞衰老相关蛋白p16，p21的mrna水平。

结论：老年大鼠骨髓间充质干细胞tpp1过表达后能明显改善其年龄相关衰老，从而可进一步增强细胞移植的疗效。