一种稳定表达外源性EX－4基因的骨髓源间充质干细胞株的制作方法

本发明涉及一种稳定表达外源性exendin-4(ex-4)基因的骨髓源间充质干细胞株及其制备方法，并且这种细胞株能够有效的抑制胰岛β细胞凋亡，促进增殖的作用。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是一种具有多向分化潜能的干细胞，其能通过直接或间接的多种方式发挥治疗糖尿病的作用。最近研究发现mscs在高糖、高脂、低氧等恶劣条件下生存能力、增殖能力、分化能力降低，且mscs经过体外培养后，其表面ccr2等炎症相关分子表达降低，使mscs向炎症部位的迁移能力降低，大大限制了mscs的治疗作用。

近来发现mscs表面表达glp-1r，且有研究表明在体外用glp-1处理mscs后，mscs的生存能力、增殖能力、分化能力、迁移能力都增强。glp-1类似物毒蜥外泌肽ex-4是从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中发现的一种激素物质，其也是glp-1r激动剂，而且与glp-1r的亲和力比glp-1更强，但其体内半衰期只有3-4h，治疗效果不佳。因此本发明在mscs中过表达ex-4，使mscs持续表达ex-4，发现其对胰岛β细胞有较好的保护作用。

技术实现要素：

本发明涉及一种稳定表达外源性ex-4基因的骨髓源间充质干细胞株，解决目前ex-4半衰期短和mscs不稳定的问题。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：

通过慢病毒感染获得稳定表达ex-4的mscs细胞株。本发明所用的慢病毒是由plvth-pol-ires-puro慢病毒过表达系统转染293t细胞获得，慢病毒过表达系统包括plvth-ex-4质粒、包膜质粒pmd2.g、包装质粒p8.91。plvth-ex-4由慢病毒过表达载体质粒plvth-pol-ires-puro和ex-4目的基因经过双酶切再经t4连接酶连接获得。

稳定表达ex-4的mscs细胞株能够促进胰岛β细胞增殖，抑制凋亡，对胰岛β细胞有很好的保护作用。其特征在在于它能够在上抑制bax基因转录，cleaved-caspase-9、beclin-1蛋白的表达。

附图说明

图1慢病毒过表达系统中过表达载体的具体结构

图2转染荧光图

图3感染荧光图

图4rt-pcr检测ex-4的表达

图5mtt检测mscs凋亡情况

图6rt-pcr检测mscs的bax表达

图7westernblot检测mscs中cleaved-caspase-9表达

图8westernblot检测mscs中beclin-1和p-ulk1的表达

图9划痕实验检测mscs、mscs-ha、mscs-ex-4三种细胞的迁移能力

图10mtt检测min6细胞活力

图11rt-pcr检测min6的bax表达

图12westernblot检测min6中cleaved-caspase-9表达

图13westernblot检测min6中beclin-1和p-ulk1的表达

具体实施方式

1.一种稳定表达外源性ex-4的骨髓源间充质干细胞株的建立方法，它包括以下步骤：

1)骨髓源间充质干细胞的培养：mscs细胞购于上海通派生物科技有限公司，在mscs完全培养基，于37℃，5％co2培养箱中培养。所用的mscs完全培养基是含10％fbs(澳洲胎牛血清)f12培养基。

2)plvth-ex-4过表达载体的构建：ex-4完整的基因序列由生物公司合成，通过t4dna连接酶将ex-4基因与plvth-pol-ires-puro过表达质粒连接，并转化到dh5a大肠埃希菌中，通过克隆筛选与鉴定获得plvth-ex-4过表达载体。

3)转染293t细胞获得慢病毒：293t细胞来自于中国药科大学，用含有10％fbs的dmem培养基，在37℃，5％co2培养箱中培养。plvth-ex-4、包膜质粒pmd2.g和包装质粒p8.91按3∶2∶1的比例共转染293t细胞，所用的转染试剂为lipfectamine6000，处理48-60h观察荧光强度，收集上清2000rpm离心5min，去除细胞沉淀，并用0.45μm滤膜过滤，得到慢病毒。

4)慢病毒感染mscs细胞株：感染前24h时，将mscs铺于6孔板中，在细胞融合度在40％-50％左右感染最佳。将病毒上清和预热的新鲜完全培养基按3∶1混合，加入终浓度为8μg/ml的polybrere并混匀，然后加入6孔板，进行感染。感染24h，换液，48h和72h时观察荧光，获得稳定表达ex-4的mscs细胞株。

2.所述过表达ex-4能增强mscs自身抗凋亡能力、增殖能力、迁移能力；具体实施方式如下：

1)mtt检测mscs细胞活力

将mscs、mscs-ha、mscs-ex-4三种细胞铺于96孔板，每孔5×10³个细胞，每组6个复孔，用终浓度0.3mmh2o2处理12h。去掉上清后每孔加入5mg/ml的mtt溶液10μl，培养箱孵育4h，然后去掉上清，每孔加入dmso150μl，摇床低速震摇10min，使结晶充分溶解，测定od490。

2)rna水平检测bax表达

通过rt-pcr检测不同组别baxmrna的表达水平，显示过表达ex-4组较模型组明显下降。

3)westernblot检测beclin-1、cleaved-caspase-9和p-ulk1的表达

westernblot检测不同组别mscs中cleaved-caspase-9、beclin-1和p-ulk1的表达情况，显示过表达ex-4组较模型组明显下降。

3.mscs迁移实验

用10μl枪头垂直在孔中央划痕，用1mlpbs洗3遍，然后加入含1％fbs的f12培养基，显微镜下拍照，记为0h，继续培养24h，拍照，并与0h时的比较。

4.所述过表达ex-4的mscs能增强min6抗凋亡能力、增殖能力；具体实施方式如下：

1)mtt检测min6细胞活力

将min6细胞铺96孔板，每孔5×10³个细胞，mscs细胞培养48h的条件培养基处理6h作为实验组，终浓度5mmstz处理24h。每孔加入5mg/ml的mtt溶液10μl，培养箱孵育4h，然后去掉上清，每孔加入dmso150μl，摇床低速震摇10min，使结晶充分溶解，测定od490。

2)rna水平检测bax表达

通过rt-pcr检测不同组别min6细胞中baxmrna的表达水平，显示过表达ex-4的mscs能显著抑制min6中baxmrna的表达。

4)westernblot检测beclin-1、cleaved-caspase-9和p-ulk1的表达

westernblot检测不同组别min6中cleaved-caspase-9、beclin-1和p-ulk1的表达情况。显示过表达ex-4的mscs能显著抑制min6中cleaved-caspase-9、beclin-1和p-ulk1的表达。