本发明属药物化学和药理学领域，涉及(r)-四氢angustine衍生物及制备，以及该类化合物作为拓扑异构酶i抑制剂在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
拓扑异构酶i(topoi)是dna解螺旋过程中一个非常重要的酶，广泛存在于哺乳生物中。在dna解螺旋时，topoi的活性位点中酪氨酸的oh基团亲核进攻dna链上的磷酸酯基团，使一条dna链断裂，然后断裂的dna链绕着未断裂的dna链旋转，最终使dna解螺旋。抗癌药物的研发是当今药物研究的热门课题之一，而topoi是肿瘤治疗的重要靶点。从分布于中国中南、西南的喜树中提取得到的喜树碱，作为经典的拓扑异构酶i抑制剂，具有优秀的抗肿瘤活性，并衍生出一系列喜树碱类抗癌药物，如拓扑替康、伊立替康等。
四氢angustine生物碱被发现广泛分布于nauclea科植物中，它们的吲哚并[2':3',3:4]吡啶并[1,2-b]萘啶母核结构吸引了化学家们的注意，数种全合成的方法也被提出，但存在反应路线冗长、反应条件苛刻、产率低等问题。(r)-四氢angustine生物碱曾被报道过通过植物分离得到的vincosamide经结构修饰得到，但是该反应路线中用到adams、浓氨水这类对反应设备苛刻的试剂，且未对(r)-四氢angustine生物碱进行n-衍生化。此外，其消旋体四氢angustine生物碱仅被报道具有抗t-24、mk肿瘤细胞增殖活性和抗炎活性，其药理学活性及作用靶点仍有待探索。
技术实现要素：
本发明的目的是提供三个(r)-四氢angustine衍生物及其可药用的盐，具有以下结构式：
本发明的另一个目的是提供(r)-四氢angustine衍生物及其可药用的盐的制备方法，通过以下方案实现：色胺(ii)和裂环马钱子碱(iii)在化学酸催化下发生pictet-spengler(ps)反应得到消旋体产物，但是r构型产物在反应体系中溶解性较差，以沉淀形式析出，经过滤分离得到单一r构型化合物vincosamide(iv)，用氢气(h2)10％pd还原iv制得化合物v，化合物v在葡萄糖苷酶(glucosldase)的作用下，脱去葡萄糖制得化合物vi，化合物vi与乙酸铵(nh4oac)反应制得化合物vii，化合物vii在对甲苯磺酸(p-tsoh)的催化下制得化合物viii，化合物viii在无机碱的作用下，与r-x(酰氯试剂)发生取代反应制得化合物i。其中，由色胺(ii)与裂环马钱子碱(iii)制备iv所用的化学酸选用乙酸、盐酸、硫酸中的任意一种，由化合物viii制备i时所用的无机碱选用氢化钠、叔丁醇钾、氢氧化钠中的任意一种。合成反应式为：
本发明的又一目的是提供(r)-四氢angustine衍生物及其可药用的盐作为拓扑异构酶i抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。体外拓朴异构酶i抑制实验表明，(r)-四氢angustine衍生物对拓朴异构酶i有良好的抑制作用；体外药理实验表明，(r)-四氢angustine衍生物对hepg2细胞株有较好的体外抑制增值的作用。
本发明利用色胺和裂环马钱子碱在化学酸催化下发生ps反应得到的r构型产物vincosamide在反应体系中溶解性较差，以沉淀形式析出的特性，通过过滤方式，从消旋体产物中分离得到单一r构型产物vincosamide，再经结构修饰得到(r)-四氢angustine衍生物，并发现其中具有突出的topoi抑制活性与体外抗hepg2肿瘤活性的化合物。本发明通过简单的化学方式，合成了一类单一手性的多环母核化合物，并且探索出这类化合物的拓朴异构酶i抑制活性，表现出良好的抗hepg2肿瘤细胞增殖活性。
附图说明
图1是合成的(r)-四氢angustine衍生物(500μm)对topoi体外抑制活性结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明。下述实施例给出了代表性化合物的合成及相关结构鉴定数据。必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：3β(r)-vincosamide(iv)的化学酸催化法制备
在氮气保护下，将色胺ii(0.4g,2.5mmol)和裂环马钱子碱iii(1.1g,2.5mmol)溶解在10ml纯净水中，加入500μl乙酸，100℃反应6小时。待反应完成后，过滤得到黄色固体，用水洗涤3次，得到3β(r)-vincosamide(iv)0.54g，收率46％。
实施例2：3β(r)-二氢vincosamide(v)的制备
将化合物iv(3.00g,6.00mmol)溶于50ml甲醇中，加入10％钯碳(300mg)并在室温下反应过夜，过滤除去钯碳，减压蒸馏除去溶剂，得到黄色固体2.98g,收率98％。
实施例3:3β(r)-二氢vincosamide苷元(vi)的制备
将化合物v(300mg,0.6mmol)溶于乙酸-乙酸钠缓冲液(ph＝5.0，100ml)，加入5.0mg葡萄糖苷酶，37℃下孵育3天，然后用乙酸乙酯萃取(50ml×3)，合并有机相，减压浓缩得到粗产物，然后进行快速柱层析，得到黄色油状液体158mg，收率75％。
实施例4:(1r,13bs,14as)-1-乙基-2-羟基-1,2,3,7,8,13b,14,14a-八氢吲哚并[2',3':3,4]吡啶并[1,2-b][2,7]萘啶-5(13h)-酮(vii)的制备
将化合物vi(150mg,0.44mmol)溶于1ml乙醇，加入乙酸铵(340mg,4.4mmol)，在80℃反应6小时。反应完成后，减压蒸馏除去乙醇，并进行快速柱层析，得到产物125mg,直接投入下步反应。
实施例5:(s)-1-乙基-7,8,13b,14-四氢吲哚并[2',3':3,4]吡啶并[1,2-b][2,7]萘啶-5(13h)-酮(viii)的制备
将化合物vii(125mg)溶于5ml甲苯，加入催化量的对甲苯磺酸，80℃反应5小时。待反应完成后，减压蒸馏除去甲苯得粗产物，经柱层析得到黄色固体40mg，收率40％。
实施例6：(r)-1-苯甲酰基-7,8,13b,14-四氢吲哚并[2',3':3,4]吡啶并[1,2-b][2,7]萘啶-5(13h)-酮(i-a)的制备
将化合物viii(10mg,0.03mmol)溶于1ml四氢呋喃中，在氮气保护下，滴加至冰的t-buok(8mg,0.06mmol)的thf(0.5ml)悬浮液中，搅拌20分钟，再将苯甲酰氯(0.05mmol)加入反应体系中，反应3─4小时。待反应完成后，加入饱和氯化铵溶液淬灭，乙酸乙酯萃取(3×3ml)，合并有机相，减压蒸馏除去有机溶剂，得粗产物，经柱层析得到，白色固体8mg，收率61％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ＝9.15(1h,s),8.49(1h,s),7.80(2h,d,j＝7.0hz),7.72(1h,t,j＝7.5hz),7.58(2h,t,j＝7.0hz),7.54(1h,d,j＝7.5hz),7.23(1h,t,j＝7.0hz),7.06(1h,t,j＝7.5hz),6.62(1h,d,j＝7.5hz),5.46(1h,d,j＝13.0hz),5.31(1h,ddd,j＝13.0,5.0,1.5hz),3.46(1h,dd,j＝16.0,3.5hz),3.09(1h,td,j＝12.0,3.5hz),3.00(1h,m),2.93(1h,m),2.74(1h,dd,j＝16.0,13.0hz),2.53(2h,q,j＝7.5hz),1.10(3h,t,j＝7.5hz)；13cnmr(125mhz,chcl3):δ＝169.4,163.7,152.0,148.1,143.1,140.3,137.2,135.0,134.8,133.4,133.2,132.0,129.3,128.5,124.3,123.2,119.3,118.9,114.4,52.0,38.2,30.9,23.0,21.5,14.3.hresi-ms[m+h]+422.1869。
实施例7：(r)-1-(4-氯苯甲酰氯基)-7,8,13b,14-四氢吲哚并[2',3':3,4]吡啶并[1,2-b][2,7]萘啶-5(13h)-酮(i-b)的制备
操作过程参见实施例6，只是用4-氯苯甲酰氯代替苯甲酰氯，得到黄白色固体，收率58％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ＝9.18(1h,s),8.54(1h,s),7.80(2h,d,j＝8.0hz),7.59(2h,d,j＝8.0hz),7.57(1h,d,j＝7.5hz),7.28(1h,t,j＝7.0hz),7.11(1h,t,j＝7.5hz),6.65(1h,d,j＝7.5hz),5.51(1h,d,j＝13hz),5.31(1h,dd,j＝13.0,5.0hz),3.46(1h,dd,j＝16.0,3.5hz),3.11(1h,td,j＝12.0,3.5hz),3.01(1h,m),2.91(1h,m),2.75(1h,dd,j＝16.0,13.0hz),2.55(2h,q,j＝7.5hz),1.13(3h,t,j＝7.5hz)；13cnmr(125mhz,chcl3):δ＝168.3,163.6,151.9,147.9,143.2,140.1,137.0,134.8,133.0,128.7,128.6,124.5,123.4,119.7,119.0,114.3,52.0,38.2,30.9,23.0,21.4,14.3.hresi-ms[m+h]+456.1479。
实施例8：(r)-1-乙酰基-7,8,13b,14-四氢吲哚并[2',3':3,4]吡啶并[1,2-b][2,7]萘啶-5(13h)-酮(i-c)的制备
操作过程参见实施例6，只是用乙酰氯代替苯甲酰氯，得到白色固体，收率38％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ＝9.17(1h,s),8.51(1h,s),7.75(1h,t,j＝8.0hz),7.56(1h,d,j＝8.0hz),7.08(1h,t,j＝8.0hz),6.64(1h,d,j＝8.0hz),5.59(1h,d,j＝13.0hz),5.31(1h,dd,j＝13.0,5.0hz),3.48(1h,dd,j＝16.0,3.5hz),3.11(1h,td,j＝12.0,3.5hz),3.02(1h,m),2.96(3h,s),2.86(1h,m),2.75(1h,dd,j＝16.0,13.0hz),2.55(2h,q,j＝7.5hz),1.12(3h,t,j＝7.5hz)；13cnmr(125mhz,chcl3):δ＝169.4,163.7,152.0,148.0,141.8,136.0,135.3,131.9,129.6,125.0,123.6,122.1,119.5,119.3,114.5,53.8,38.2,31.6,27.6,21.4,14.7.hresi-ms[m+h]+360.1712。
为了更好地理解本发明的实质，下面通过药理实施例进一步说明本发明。药理实施例给出了代表性化合物的部分活性数据。必须说明，下述药理实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例9:抗肿瘤生物活性测试方法：
肿瘤细胞离体培养：选取肿瘤细胞hepg2于37℃、5％co2细胞培养箱中孵育，带细胞密度长到70-90％后，用puck’sedta消化后传代，用于以后实验所需。
mtt法测定(r)-四氢angustine衍生物对hepg2肿瘤细胞的体外抗增殖作用：
将处于对数生长期的hepg2肿瘤细胞稀释到4×104个细胞/ml，在96孔细胞培养板中每孔加入0.1ml，然后加入浓度为20.0μm，10.0μm，5.0μm，1.0μm的待测化合物，共同于37℃、5％co2细胞培养箱中孵育72小时，以dmso(1％)为对照。72小时后，加入终浓度为0.25mg/ml的mtt，于7℃、5％co2细胞培养箱中孵育4小时，之后吸干溶剂，每孔加入100μldmso，用酶联免疫仪于570nm处测定吸光度(od值)，所得数据用于计算ic50。所得结果见表1。
表1合成的(r)-四氢angustine衍生物对hepg2肿瘤细胞的ic50(μm)值
从上表1中可以看出化合物i系列对人肝癌hepg2肿瘤细胞株表现出良好的抑制作用，有可能发展成为新的具有抗肝癌作用的药物。
实施例10:(r)-四氢angustine衍生物对拓朴异构酶i体外抑制活性测试方法：
取样品各1μl，与10×topoireactionbuffer1μl混合，再加入0.1％bsa1μl，pbr322dna(50ng/μl)1μl及topoi(0.2u/μl)1μl，最后用depc水定容至10μl，置37℃。水浴反应30min[每组实验均设空白对照及阴性对照。空白对照即体系中不加topoi和药物样品(200μm)，用depc水补足体积；阴性对照即体系中不加药物样品，同样用depc水补足体积]。
水浴反应后，于上述各反应液(10μl)中加入6×loadingbuffer2μl，上样于0.8％琼脂糖凝胶上，tbe缓冲液中，100v电压下进行电泳60分钟。60分钟后，将电泳完毕的胶置于溴化乙淀(eb)溶液中染色，凝胶成像并分析。所得结果见图1。图1结果表明，化合物i系列对topoi有良好的抑制活性，有望成为新型拓朴异构酶i抑制剂。