本发明涉及血红素制备技术领域，特别是指一种血红素提取方法。
背景技术：
血红素(heme)又称铁卟啉，由原卟啉ⅸ与一个铁离子络合而成，广泛存在于动物的血液、肌肉和某些植物组织中，是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素c、过氧化氢酶和过氧化物酶等的辅基。血红素在血液中主要存在于红细胞内，一分子珠蛋白与四分子血红素以非共价键结合。血红素具有重要的生理功能和很高的应用价值，在医药、食品、化工、保健品行业中有广泛应用。在临床上，血红素是目前治疗缺铁性贫血的一种疗效较好的补铁剂，与常用的硫酸亚铁、富马酸铁、葡萄糖酸亚铁等化学补铁剂比较，具有生物利用度高、无体内铁蓄积中毒及胃肠刺激等优点；血红素与edta配合还可用于治疗铅中毒。在制药工业中，血红素是制备用于治疗恶性肿瘤的血卟啉类药物和治疗急、慢性迁延性、慢性活动性肝炎的原卟啉钠的原料。在食品行业，血红素是一种天然色素，可替代熟肉制品中危及人体健康的发色剂亚硝酸盐及人工合成色素，减少亚硝酸盐的致癌作用，并能保持肌肉固有的天然色泽。血红素作为一种高效铁源物质，已在饲料生产中开始应用，成为一种新型绿色饲料添加剂。在分析化学上，血红素可用来鉴定铜。
此外，我国每年猪血总量约有150万吨，除极少量用于制作血豆腐或饲料外，大部分被废弃，造成资源浪费和环境污染。可见，综合开发利用猪血资源提取血红素，既可以减少环境污染，又可以增加猪血的经济效益和社会效益，具有很高的应用价值和较好的市场前景。所以，研究血红素的提取技术意义重大。
目前国内血红素的研究比较热门，但生产上分离提取仍未突破传统的方法，依然采用的是酸性丙酮沉淀法。此方法先用氯仿沉淀猪血球中的血红蛋白，然后过滤收集沉淀，加入5倍体积2.5％的浓盐酸丙酮溶液，搅拌浸提，收集丙酮血红素溶液，最后真空抽滤回收丙酮，获得血红素纯品。这种传统方法的缺点是工艺复杂，使用大量有机溶剂，不安全环保，得到的血红素油性大，需要蒸馏塔等大型设备，设备投入很大，产品纯度低，产品成本高，应用受到限制。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种血红素提取方法，该提取方法采用酶解法从抗凝猪血中提取血红素，避免了传统有机溶剂带来的化学污染，安全环保，生产工艺简单可控，血红素产品产量高，纯度可达96.8％以上。
基于上述目的，本发明提供的一种血红素提取方法，包括以下步骤：
(1)将抗凝猪血离心后，收集红血球液，将红血球液与水混合后，搅拌溶血，然后调节ph值至7～9，加入复合蛋白水解酶进行酶解；
(2)调节酶解后的酶解液ph值至3～3.5，静置后收集第一沉淀物；
(3)将第一沉淀物溶于氢氧化钠溶液中并调节ph值至7～9，离心取上清液，上清液中加入无水氯化钙沉淀血红素，离心收集第二沉淀物；
(4)将第二沉淀物洗涤至中性，收集第三沉淀物；
(5)将第三沉淀物烘干，即得血红素。
在本发明的血红素提取方法中，首先，将红血球液与适量水混合，同时配以适量的机械作用(如搅拌)，使红细胞溶血。红细胞充分破壁后，采用复合蛋白水解酶进行酶解，血红蛋白经酶解后肽链被断开，酶解液中有血红素。再者，根据血红素在酸性条件下溶解性很小的性质，调节酶解液的ph值然后静置离心，可以使血红素沉淀出来，得到血红素粗品。接着，将血红素粗品溶于氢氧化钠溶液中进行纯化，并采用无水氯化钙重新沉淀血红素，收集血红素沉淀并洗涤至中性，烘干得血红素。
在本发明中，优选的，步骤(1)中所述红血球液与水的质量比为1:1.5～2.5，搅拌溶血的时间为20～40min，所述复合蛋白水解酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，所述木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为4:4:2，且所述复合蛋白水解酶的加入量为红血球液质量的3‰～5‰。
本发明在血红素提取过程中加水，主要目的在于溶血，破坏红细胞，从而使血红蛋白游离，以便血红素的提取。将红血球液与适量水混合后，降低了细胞外渗透压，使红细胞吸水导致细胞膜破裂，同时配以适量的机械作用(如搅拌)，可以提高破裂速度。因此加水量和搅拌溶血时间会影响红细胞的溶解效果，发明人根据试验结果，确定了最佳的加水量和搅拌溶血时间。
本发明采用复合蛋白水解酶酶解血红蛋白，复合蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，其中碱性蛋白酶属于一种内切酶，可用于各种蛋白质的水解，采用碱性蛋白酶，可以很快将血红蛋白降解为小的肽段；木瓜蛋白酶为外切酶，在内切酶和外切酶的共同作用下，产生一定量的游离氨基酸和小肽，提高了水解度；同时胰蛋白酶能显著提高血红素的量。
在本发明中，优选的，步骤(1)中所述酶解的温度为55～58℃，所述酶解的时间为4～6h。
本发明还对酶解的条件进行了优化，试验结果表明，在酶解过程中，适当的提高温度可增加酶的活力，促进水解，若温度过高，使血红蛋白和酶变性则对水解不利，因此选择55～58℃为复合蛋白水解酶适宜的酶解温度。ph作为变性因素的存在，使血红素上的丙酸基与珠蛋白结合的两个化学键及血红素中的铁与珠蛋白组氨酸咪唑环的氮形成的两个配位键断裂，从而使血红蛋白中的血红素与珠蛋白分离达到水解目的，不同的ph处理会对底物和酶的构象造成较大影响，ph应该控制在反应最适范围内有利于酶活力的充分发挥，因此ph在7～9是较优选择。酶解时间的长短会直接影响整个反应，水解时间过短导致反应不充分，不能完全水解血红蛋白释放出血红素，水解时间过程时作用底物被消耗水解度随之下降，由于水解产物被氧化以及在体系中达到溶解平衡，致使血红素浓度和水解度反而减小，从原料利用和水解产物等方面，选择酶解的时间为4～6h。
在本发明中，优选的，步骤(2)中所述静置的时间为0.5～1.5h。
在本发明中，优选的，步骤(3)中所述氢氧化钠溶液与所述第一沉淀物的质量比为4～6:1，所述无水氯化钙的加入量为第一沉淀物质量的0.2％～0.3％。
在本发明中，将第一沉淀物用氢氧化钠溶液溶解，氢氧化钠溶液的浓度为5％，溶解液ph为9.0，离心除去不溶性的珠蛋白杂质，收集上清液，加入无水氯化钙使血红素重新沉淀析出，离心，收集第二沉淀物。
在本发明中，优选的，步骤(4)中将第二沉淀物洗涤至中性具体分为以下步骤：
a.将第二沉淀物溶于乙二胺四乙酸二钠溶液中洗涤，吸附杂质；
b.然后用硝酸溶液进行洗涤，除杂质；
c.最后用双蒸水洗涤至中性。
在本发明中，优选的，步骤a中所述乙二胺四乙酸二钠溶液的质量分数为0.05％～0.15％，所述乙二胺四乙酸二钠溶液与所述第二沉淀物的质量比为3～5:1。
在本发明中，优选的，步骤b中所述硝酸溶液的ph值为1.8～2.2。
在本发明中，第二沉淀物为血红素粗品，先用乙二胺四乙酸洗涤第二沉淀物，再用硝酸溶液洗涤，最后用双蒸水洗涤至中性，采用上述步骤洗涤第二沉淀物，能显著提高最终产品血红素的纯度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用酶解法从抗凝猪血中提取血红素，相对于传统有机溶剂法是一种绿色环保的方法，对得到的血红素粗品进行多次纯化处理，纯度可达96.8％以上。本发明的血红素提取方法成本低廉，制备效率高，安全环保，生产工艺简单可控，产品收率高，产品纯度高，具有较好的经济效益和社会效益，市场前景十分乐观。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
以下实施例中所使用的抗凝猪血采用以下方法制备得到：将免疫合格的猪血收集于桶，立即加入一定比例的抗凝剂，抗凝剂可选用柠檬酸钠，柠檬酸钠能与猪血中的钙离子结合生成可溶性的螯合物，使参与凝血过程中所必须的钙离子不能发挥作用，从而阻止了血液的凝固。具体为：将健康新鲜猪血收集到加有抗凝剂柠檬酸三钠的容器内，并使健康新鲜猪血中柠檬酸三钠的重量百分比浓度维持在约1.0％，搅拌均匀，即得抗凝猪血。
实施例1血红素纯度的测定方法
1.1标准试液的制备
用分析天平称取在105℃的温度下干燥至恒重的血红素对照品20.0mg，放置于100ml的容量瓶中后定容，用配制好的0.1mol/l的naoh溶液稀释至准确刻度，摇匀后静置备用。
1.2血红素对照品的光谱图检测
吸取制备好的血红素标准试液1ml，加入到100ml的容量瓶中，用配备好的0.1mol/l的naoh溶液定容，摇匀后静置一段时间，然后放置在紫外可见光分光光度计中，在250～800nm波长范围内进行扫描，根据显示结果，吸光度(a)曲线在387nm处有最大吸收波长。
1.3标准曲线的制备
用吸管分别量取配好的血红素标准溶液1、2、3、4、5ml，分别置于100ml容量瓶中，用配备好的0.1mol/l的naoh溶液定容至刻度，摇匀后静置备用，检测以0.1mol/l的naoh溶液为参照空白，在387nm波长下分别测定吸光度(a)，得到标准曲线的回归方程为：y＝0.0894x-0.0067，相关系数r2＝0.9992。
1.3血红素纯度的计算
样品中血红素纯度(％)＝样品溶液浓度/同量标准品的浓度
实施例2血红素的提取
本实施例中血红素提取方法，包括以下步骤：
(1)将100kg抗凝猪血离心后，收集红血球液40kg，将40kg红血球液与2倍水(即80kg水)混合后，搅拌30分钟溶血，放入加热反应罐中调ph为9，并加热温度至56℃，再加入4‰复合蛋白水解酶(复合蛋白水解酶的加入量为红血球液质量的4‰，即0.16kg复合蛋白水解酶)，恒温56℃，酶解5小时；其中复合蛋白水解酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物；
(2)调节酶解后的酶解液ph值至3～3.5，静置1小时后，压滤或离心，收集第一沉淀物(干物质约7kg)；
(3)将第一沉淀物溶于5倍氢氧化钠溶液(即35kg氢氧化钠溶液)中并调节ph值至9，搅拌溶解，离心去沉淀取上清液，上清液中加入无水氯化钙20g，搅拌均匀，静置，血红素迅速沉淀，离心收集第二沉淀物；
(4)将第二沉淀物溶于5倍0.1％质量浓度的乙二胺四乙酸二钠溶液(即0.1％质量浓度的乙二胺四乙酸二钠溶液与第二沉淀物的质量比为5:1)洗涤，然后用ph2的硝酸溶液洗涤，最后用双蒸水洗涤至中性，收集第三沉淀物；
(5)将第三沉淀物烘干至恒重，得血红素产品40g。
将血红素对照品与提取的血红素产品分别在400cm-1～4000cm-1范围内扫描红外光谱。结果显示，血红素产品的红外光谱图与对照品的基本一致，波形相似，从二者吸收峰的位置和强度可知两种物质结构相同，为同一种物质，即血红素。按照实施例1的方法进行血红素纯度的检测，本实施例得到的血红素纯度经检测为96.8％。
实施例3血红素的提取
本实施例中血红素提取方法，包括以下步骤：
(1)将100kg抗凝猪血离心后，收集红血球液40kg，将40kg红血球液与1.5倍水(即60kg水)混合后，搅拌20分钟溶血，放入加热反应罐中调ph为7，并加热温度至55℃，再加入3‰复合蛋白水解酶(复合蛋白水解酶的加入量为红血球液质量的3‰，即0.12kg复合蛋白水解酶)，恒温55℃，酶解4小时；其中复合蛋白水解酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物；
(2)调节酶解后的酶解液ph值至3～3.5，静置0.5小时后，压滤或离心，收集第一沉淀物(干物质约6.5kg)；
(3)将第一沉淀物溶于4倍氢氧化钠溶液(即26kg氢氧化钠溶液)中并调节ph值至7，搅拌溶解，离心去沉淀取上清液，上清液中加入无水氯化钙13g，搅拌均匀，静置，血红素迅速沉淀，离心收集第二沉淀物；
(4)将第二沉淀物溶于3倍0.05％质量浓度的乙二胺四乙酸二钠溶液(即0.05％质量浓度的乙二胺四乙酸二钠溶液与第二沉淀物的质量比为3:1)洗涤，然后用ph1.8的硝酸溶液洗涤，最后用双蒸水洗涤至中性，收集第三沉淀物；
(5)将第三沉淀物烘干，得血红素产品37g。
将血红素对照品与提取的血红素产品分别在400cm-1～4000cm-1范围内扫描红外光谱。结果显示，血红素产品的红外光谱图与对照品的基本一致，波形相似，从二者吸收峰的位置和强度可知两种物质结构相同，为同一种物质，即血红素。按照实施例1的方法进行血红素纯度的检测，本实施例得到的血红素纯度经检测为97.0％。
实施例4血红素的提取
本实施例中血红素提取方法，包括以下步骤：
(1)将100kg抗凝猪血离心后，收集红血球液40kg，将40kg红血球液与2.5倍水(即100kg水)混合后，搅拌40分钟溶血，放入加热反应罐中调ph为8，并加热温度至58℃，再加入5‰复合蛋白水解酶(即0.2kg复合蛋白水解酶)进行酶解；其中复合蛋白水解酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物；
(2)调节酶解后的酶解液ph值至3～3.5，静置1.5小时后，压滤或离心，收集第一沉淀物(干物质约6.8kg)；
(3)将第一沉淀物溶于6倍氢氧化钠溶液(即40.8kg氢氧化钠溶液)中并调节ph值至8，搅拌溶解，离心去沉淀取上清液，上清液中加入无水氯化钙20.4g，搅拌均匀，静置，血红素迅速沉淀，离心收集第二沉淀物；
(4)将第二沉淀物溶于5倍0.15％质量浓度的乙二胺四乙酸二钠溶液(即0.05％质量浓度的乙二胺四乙酸二钠溶液与第二沉淀物的质量比为5:1)洗涤，然后用ph2.2的硝酸溶液洗涤，最后用双蒸水洗涤至中性，收集第三沉淀物；
(5)将第三沉淀物烘干，得血红素产品38g。
将血红素对照品与提取的血红素产品分别在400cm-1～4000cm-1范围内扫描红外光谱。结果显示，血红素产品的红外光谱图与对照品的基本一致，波形相似，从二者吸收峰的位置和强度可知两种物质结构相同，为同一种物质，即血红素。按照实施例1的方法进行血红素纯度的检测，本实施例得到的血红素纯度经检测为97.4％。
对比例1
本对比例与实施例1的步骤(2)～步骤(5)完全相同，只有步骤(1)不同，具体为：
(1)将100kg抗凝猪血离心后，收集红血球液40kg，将40kg红血球液与2倍水(即80kg水)混合后，搅拌30分钟溶血，放入加热反应罐中调ph为9，并加热温度至56℃，再加入4‰碱性蛋白酶(碱性蛋白酶的加入量为红血球液质量的4‰，即0.16kg碱性蛋白酶)，恒温56℃，酶解5小时；
(2)调节酶解后的酶解液ph值至3～3.5，静置1小时后，压滤或离心，收集第一沉淀物(干物质约7kg)；
(3)将第一沉淀物溶于5倍氢氧化钠溶液(即35kg氢氧化钠溶液)中并调节ph值至9，搅拌溶解，离心去沉淀取上清液，上清液中加入无水氯化钙20g，搅拌均匀，静置，血红素迅速沉淀，离心收集第二沉淀物；
(4)将第二沉淀物用双蒸水洗涤至中性，收集第三沉淀物；
(5)将第三沉淀物烘干至恒重，得血红素产品30g。
将血红素对照品与提取的血红素产品分别在400cm-1～4000cm-1范围内扫描红外光谱。结果显示，血红素产品的红外光谱图与对照品的基本一致，波形相似，从二者吸收峰的位置和强度可知两种物质结构相同，为同一种物质，即血红素。按照实施例1的方法进行血红素纯度的检测，本实施例得到的血红素纯度经检测为97.5％。
本对比例只采用碱性蛋白酶进行酶解，不能保证将血红蛋白充分地酶解，从而导致最终得到的血红素产品量大幅度减少。由此说明，本发明采用复合蛋白水解酶能够充分地酶解血红蛋白，从而得到较高的血红素产量。
对比例2
本对比例与实施例1的步骤(1)～步骤(3)，步骤(5)完全相同，只有步骤(4)不同，具体为：
(1)将100kg抗凝猪血离心后，收集红血球液40kg，将40kg红血球液与2倍水(即80kg水)混合后，搅拌30分钟溶血，放入加热反应罐中调ph为9，并加热温度至56℃，再加入4‰复合蛋白水解酶(复合蛋白水解酶的加入量为红血球液质量的4‰，即0.16kg复合蛋白水解酶)，恒温56℃，酶解5小时；其中复合蛋白水解酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物；
(2)调节酶解后的酶解液ph值至3～3.5，静置1小时后，压滤或离心，收集第一沉淀物(干物质约7kg)；
(3)将第一沉淀物溶于5倍氢氧化钠溶液(即35kg氢氧化钠溶液)中并调节ph值至9，搅拌溶解，离心去沉淀取上清液，上清液中加入无水氯化钙20g，搅拌均匀，静置，血红素迅速沉淀，离心收集第二沉淀物；
(4)将第二沉淀物用双蒸水洗涤至中性，收集第三沉淀物；
(5)将第三沉淀物烘干至恒重，得血红素产品43g。
将血红素对照品与提取的血红素产品分别在400cm-1～4000cm-1范围内扫描红外光谱。结果显示，血红素产品的红外光谱图与对照品的基本一致，波形相似，从二者吸收峰的位置和强度可知两种物质结构相同，为同一种物质，即血红素。按照实施例1的方法进行血红素纯度的检测，本实施例得到的血红素纯度经检测为85.2％。
本对比例对血红素粗品只用双蒸水洗涤至中性，导致最终得到的血红素产品的纯度大幅度下降，说明本发明先用乙二胺四乙酸洗涤血红素粗品，再用硝酸溶液洗涤，最后用双蒸水洗涤至中性，能显著提高最终产品血红素的纯度。
对比例3
本对比例采用的方法参照专利文献(申请号为201410409254.9，发明名称为：一种血红素的提取方法)，具体步骤为：
在夹套式酶解罐中加入分离获得的新鲜猪血球100kg，加水100kg混合，快速搅拌(频率30赫兹)破膜1h，然后将酶解罐温度升高到温度50℃、用稀盐酸溶液调节ph至7.0，再加入胰蛋白酶4.5kg，溶解后搅拌速度降低(频率14赫兹)，酶解10h后，调节酶解液ph至5.0，并加热至80℃维持30min，处理结束。待冷却后，用卧螺离心机分离，转速4000rpm，离心20min，收集沉淀得血红素粗品，纯度为30％。
将血红素粗品7kg放入酶解罐中，加入182kg0.5％氢氧化钠溶液并加热到90℃，快速搅拌使其溶解。待溶液冷却后，加入羧甲基纤维素钠6kg，搅拌。碟片离心机5000rpm离心分离30min，收集糊状沉淀，即cmc-血红素。
将收集的糊状沉淀8kg，加水35kg，调节ph为9，采用截留分子量为1000da的卷式超滤膜设备超滤，超滤温度为60℃，超滤压力为0.01mpa，循环超滤时间为30min。超滤后的截留物经烘干即为血红素产品，血红素产品32g。按照实施例1的方法进行血红素纯度的检测，本实施例得到的血红素纯度经检测为87％。
本对比例的方法结合酶解法和cmc吸附法来提取血红素，产品产量和纯度远远低于采用本发明的方法制备得到的血红素纯度。
对比例4
本对比例采用酸性丙酮提取法提取血红素，具体步骤为：
将100kg抗凝猪血离心后，收集红血球液40kg，将40kg红血球液与2倍水(即80kg水)混合后，搅拌均匀，用超声波细胞粉碎机在冰水浴中以200w功率，破碎10min(取少量溶血液涂片，光镜下观察未见完整红细胞，达到完全溶血)，再按5倍于溶血液体积的量加入1％盐酸丙酮溶液(即v盐酸丙酮：v溶血液＝5：1)，混匀，用1mol/l盐酸调ph至2～3，搅拌抽提10min，血红素与珠蛋白分离而溶于盐酸丙酮溶液中，珠蛋白变性沉淀，以4000r/min离心15min，收集含血红素的盐酸丙酮上清，再抽滤除去微小的珠蛋白颗粒。滤液用旋转蒸发器蒸馏回收丙酮，浓缩后血红素析出，离心收集沉淀，将沉淀用0.1mol/lnaoh溶液溶解，离心除去不溶性的珠蛋白杂质，收集上清液，再以1mol/l盐酸调ph至5～6，血红素重新沉淀析出，离心，收集沉淀，分别用双蒸水和无水乙醇洗涤2次，干燥即得血红素产品，血红素产品30g。按照实施例1的方法进行血红素纯度的检测，本实施例得到的血红素纯度经检测为83％。
采用本对比例的方法得到的血红素产品产量和纯度远远低于采用本发明的方法制备得到的血红素产量和纯度，并且该对比例工艺复杂，使用大量有机溶剂，不安全环保。
由上述内容可知，采用实施例2～4中的方法制备得到的血红素产品产量和纯度均高于对比例1～4中的血红素产量和纯度，而且本发明的血红素提取方法成本低廉，制备效率高，安全环保，生产工艺简单可控，具有较好的经济效益和社会效益，市场前景十分乐观。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。