基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因表达的检测试剂的制作方法

本发明是《基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2及foxm1基因表达的检测试剂、pcr检测方法及应用》(申请号2015103558175，申请日150624)的分案申请。

本发明属于分子生物学生物核酸检测技术领域，具体涉及一种基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2及foxm1基因表达的检测试剂、pcr检测方法及应用。

背景技术：

wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。wnt信号通路包括经典的wnt信号通路与非经典的wnt信号通路，在经典通路即wnt-β-catenin信号通路中，wnt因子通过激活细胞膜上的frizzle/lrp5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能够联合pygo2、bcl-9以及foxm1蛋白共同与tcf/lef-1转录因子家族形成复合体并激活wnt信号通路下游靶基因的转录激活。

pygo2蛋白是wnt信号通路中β-catenin下游重要成员之一，目前越来越多的研究已经发现，在很多肿瘤中pygo2蛋白均呈现高表达。

有研究发现，foxm1蛋白在wnt信号通路中也发挥着重要的作用。foxm1蛋白是一类广谱性的转录因子，具有dna损伤修复、细胞增殖、细胞周期调控、细胞新陈代谢、细胞分化以及组织自稳态的维持等多种功能。foxm1在很多肿瘤中也是高表达的。

目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，尤其是近年来wnt信号通路在癌症中的研究，以及pygo2蛋白、foxm1蛋白作为wnt信号通路重要成员其表达水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的重要问题。

肽核酸(peptidenucleicacids，pna)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的dna类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的dna类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了dna中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与dna相同，pna可以通过watson-crick碱基配对的形式识别并结合dna或rna序列，形成稳定的双螺旋结构。由于pna不带负电荷，与dna和rna之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于dna或dna、rna间的杂交，pna与dna或rna的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与dna或rna分子的杂交能力远优于dna/dna或dna/rna，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种的基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因表达的检测试剂、pcr检测方法及应用。

本发明目的的实现方式为，基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因表达的检测试剂，包括引物和探针，引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针；

所述pygo2正向引物如序列表中seqidno.1；

所述pygo2反向引物如序列表中seqidno.2；

所述pygo2肽核酸荧光探针如序列表中seqidno.7；

所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为：fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。

基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2及foxm1基因表达的检测试剂进行检测的方法，检测方法为基于肽核酸为荧光探针的实时荧光定量pcr方法；

所述实时荧光定量pcr的反应体系为：正向引物、反向引物、depc水、具有5'→3'外切活性的dna聚合酶、dntps、10×pcrbuffer、rnasin、m-mlv逆转录酶、oligo(dt)和含mg离子的溶液；

所述具有5'→3'外切活性的dna聚合酶为taq酶。

基于肽核酸pna探针的wnt信号通路中pygo2及foxm1基因表达的检测试剂的应用，其特征在于，用于制备检测肿瘤细胞及正常细胞的检测试剂，所述癌细胞为结直肠癌细胞、脑胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或肝癌细胞。

本方法采用特异序列的pna寡聚物作为探针。由于pna是一种人工合成的核酸的类似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势，大大提高了检测灵敏度。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:pygo2和foxm1基因(尤其是foxm1基因)是新发现的wnt信号通路中β-catenin蛋白下游的发挥着重要功能的基因，本发明提供了直接检测wnt信号通路中pygo2和foxm1基因表达水平变化的试剂，借助于所述检测试剂能够通过实时荧光定量pcr法在转录水平快速检测出pygo2基因和foxm1基因表达水平，而与普通实时荧光定量pcr不同的是，本发明使用的肽核酸pna荧光探针更加灵敏；本发明为抗癌药物的筛选，新靶向药物的机制研究都提供了非常有力的工具。

附图说明

图1是本发明实施例中nci-h498细胞pygo2基因pcr扩增图；

图2是本发明实施例中nci-h498细胞foxm1基因pcr扩增图；

图3是本发明实施例中所有六种细胞中pygo2基因相对内参β-catenin的表达水平比较；

图4是本发明实施例中所有六种细胞中foxm1基因相对内参β-catenin的表达水平比较；

图5是本发明实施例中所有六种细胞中pygo2蛋白和foxm1蛋白的表达情况。

具体实施方式

基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2及foxm1基因表达的检测试剂,引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针；

所述pygo2正向引物如序列表中seqidno.1；

所述pygo2反向引物如序列表中seqidno.2；

所述pygo2肽核酸荧光探针如序列表中seqidno.7；

所述肽核酸(pna)荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为：fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。

基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2及foxm1基因表达的检测试检测试剂还含有对比试剂，所述对比试剂含有内参基因β-actin的pcr反应引物及肽核酸(pna)探针，

所述β-actin正向引物如序列表中seqidno.5；

所述β-actin反向引物如序列表中seqidno.6；

所述β-actin肽核酸荧光探针如序列表中seqidno.9。

基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2及foxm1基因表达的检测试剂进行检测的方法，检测方法为基于肽核酸为荧光探针的实时荧光定量pcr方法。

所述实时荧光定量pcr的反应体系为：正向引物、反向引物、depc水、具有5'→3'外切活性的dna聚合酶、dntps、10×pcrbuffer、rnasin、m-mlv逆转录酶、oligo(dt)和含mg离子的溶液。所述具有5'→3'外切活性的dna聚合酶为taq酶。

基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2及foxm1基因表达的检测试剂进行检测的方法，实验体系可以在任何一台实时荧光定量pcr仪器上进行，其pcr反应仪器为appliedbiosystems公司7500型荧光定量pcr仪。上述引物置于八联管中，进行实时荧光定量pcr检测，实验操作简单，费用低廉，结果重复性，敏感性好，是研究肿瘤相关药物作用机理及基础科学研究的一种重要手段。

所述pcr反应液中所述taq酶的终浓度为0.01u/μl～0.05u/μl，所述dntps的终浓度为0.2～0.6mm，所述10×pcrbuffer的终浓度为1×，所述rnasin的终浓度为40u/μl～60u/μl，所述m-mlv逆转录酶的终浓度为200u/μl～320u/μl，所述mgcl2的终浓度为1.5～5.0mm，溶剂为depc水，所述正向引物的终浓度为0.05～0.9μm，所述反向引物的终浓度为0.05～0.9μm，所述荧光探针的终浓度为0.05～0.9μm。

实时荧光定量pcr的反应程序为：42℃逆转录20min；94℃预变性，2min；95℃变性，30s；58℃，45s；进行40个循环。

下面通过结直肠癌细胞进行举例说明，但是本发明不局限于结直肠癌细胞，本发明所述检测试剂可以应用于脑胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞等细胞的检测。

本发明通过培养六种细胞系：nci-h498(人结直肠腺瘤nci-h498细胞系)、sw480(人结直肠腺瘤sw480细胞系)、sw1643(人结直肠腺瘤sw1643细胞系)、dld-1(人结直肠腺瘤dld-1细胞系)、ht-29(人结直肠腺瘤ht-29细胞系)以及hct116(人结直肠腺瘤hct116细胞系)，然后利用基于肽核酸(pna)为荧光探针的wnt信号通路中pygo2和foxm1基因表达检测试剂来检测pygo2和foxm1基因表达水平的变化。

本发明中nci-h498(人结直肠腺瘤nci-h498细胞系)、sw480(人结直肠腺瘤sw480细胞系)、sw1643(人结直肠腺瘤sw1643细胞系)、dld-1(人结直肠腺瘤dld-1细胞系)、ht-29(人结直肠腺瘤ht-29细胞系)以及hct116(人结直肠腺瘤hct116细胞系)等细胞系均购自美国atcc，培养细胞所使用的rpmi-1640培养基及10％胎牛血清均购自英俊公司，其他试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。

利用本发明所述试剂检测细胞内wnt信号通路pygo2、foxm1基因表达水平的变化包括以下具体步骤：

一、引物探针设计

根据美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)报道的hpygo2mrna序列(ncbireferencesequence:nm_138300.3)，使用appliedbiosystems公司开发的primerexpresssoftwareforreal-timepcr软件设计特异的pygo2引物与探针。

pygo2-f:5'-ggccctcggagaagttagga-3'；

pygo2-r:5'-gccatctacgccgttttagtg-3'；

pygo2(pna)-p:5'fam-cctgctctggtggagctgacaacctt-bhq3'；

靶序列：

atggggtgtggccctcggagaagttaggagtcccccagctcaagatacagtggcaaagacctagtggtcccctacccccacttctctcagttcctggcatgaggagagaagaccctgctctggtggagctgacaacctttgaggctgggaggagagcagcctctgggcatcgttcccagtgtccctcacactaaaacggcgtagatggcaaccc

根据美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)报道的β-actinmrna序列(ncbireferencesequence:xm_005946208.1)，使用appliedbiosystems公司开发的primerexpresssoftwareforreal-timepcr软件设计特异的β-actin引物与探针。

β-actin-f:5'-cacggcatcgtcaccaact-3'；

β-actin-r:5'-acagcctggatagcaacgtaca-3'；

β-actin(pna)-p:5'hex-ctacaatgagctgcgtgtggctccc-bhq3'；

靶序列：

atcgagcacggcatcgtcaccaactgggacgacatggagaaaatctggcaccacaccttctacaatgagctgcgtgtggctcccgaggagcaccccgtgctgctgaccgaggcccccctgaaccccaaggccaaccgcgagaagatgacccagatcatgtttgagaccttcaacaccccagccatgtacgttgctatccaggctgtgctatc

根据美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)报道的foxm1mrna序列(ncbireferencesequence:nm_001243088.1)，使用appliedbiosystems公司开发的primerexpresssoftwareforreal-timepcr软件设计特异的foxm1引物与探针。

以上：f：forward，正向；hw-f表示用于检测钩虫核酸的正向引物。

r：reverse，反向；hw-r表示用于检测钩虫核酸的反向引物。

p：probe，荧光探针；hw-p表示用于检测钩虫核酸的荧光探针，该荧光探针为taqman荧光探针。

在本发明实施例中，修饰荧光探针的5'端的荧光报告基团可以为：fam，hex，tet，joe，vic，rox，cy3或cy5；修饰荧光探针的3'端的淬灭基团可以为：tamra，eclipse，bhq1，bhq2，bhq3或dabcyl，该荧光报告基团与淬灭基团不影响荧光定量pcr的扩增，只需根据探针的荧光报告基团和淬灭基团选择所用的仪器的型号设置可检测的荧光信号范围。本发明实施例提供的荧光探针荧光报告基团：fam、hex、tet和fam的激发波长为470-650nm，接收波长为500-700nm；淬灭基团：eclipse、tamra、bhq1。引物合成后的纯化方式可以为：hap、page和hplc纯化方式。

荧光探针荧光报告基团：fam、hex、tet和fam的激发波长为470-650nm，接收波长为500-700nm。

二、nci-h498、sw480、sw1643、dld-1、ht-29以及hct116培养与传代1)细胞培养

所有细胞系使用rpmi-1640培养基(invitrogen,carlsbad,ca)，10％胎牛血清(invitrogen,carlsbad,ca)，于37℃、5％co2环境下培养。

2)细胞传代

以nci-h498细胞为例，首先使用灭菌吸管将细胞培养皿中的培养液吸出，加入pbs缓冲液清洗2遍，往细胞中慢慢滴加适量胰蛋白酶，待细胞变圆，调整角度细胞能够移动后加入3ml的含10％胎牛血清的dmem培养基，反复轻轻吹打后，显微镜下观察细胞形态并计数，根据培养皿中细胞的含量将适量的细胞传代至其他灭菌的培养皿中，加入5ml的dmem培养基后放入5％co2培养箱。

细胞计数公式(个/ml)：(4大格细胞总数)×10⁴×稀释倍数/4

三、总rna的提取

1)倒掉培养基，pbs清洗后，直接将1mltrizol注入培养瓶(其中细胞5×10⁶个/ml)，反复抽吸均匀；

2)在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为trizol总体积的1/5)，振荡混均30秒，室温下静置5分钟；

3)12000rpm4℃离心15分钟，分相为三层。上层：rna(约为trizol的60％)；中间：dna；下层:蛋白质(酚-氯仿)；

4)小心吸取上清液，转移到另一ep管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.4～0.6ml。有机相和中间层含有dna和蛋白质,避免触及；

5)上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡混均30秒。室温下静置10分钟；

6)12000rpm4℃离心10分钟；

7)rna沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注意避免吸弃rna沉淀；

8)离心管加入1ml预冷的75％乙醇(1mltrizol至少1ml乙醇清洗dna),振荡混均30秒，使沉淀振荡起来，室温12000rpm离心1～2分钟。尽可能吸弃上清液,防止rna沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。在75％乙醇中，rna在4℃至少保存1周，-20℃至少保存1年；

9)室温选择流动性小，倒置离心管于滤纸上，干燥rna，但不能完全干燥(5～10分钟)。用depc水15μl溶解沉淀，55-60℃孵育10～15分钟。

10)rna纯度检测

滴加2μlrna溶液于超微量分光光度计(型号：p330-311)，并读取仪器中od260/od280比值。

四、实时荧光定量pcr

取提取的总rna1-5μg，加入pcr反应液，pcr反应液包括：无菌水、具有5'→3'外切活性的dna聚合酶、dntps、10×pcrbuffer、rnasin、m-mlv逆转录酶、oligo(dt)和含mg离子的溶液。其中，浓度为5u/μl的具有5'→3'外切活性的dna聚合酶0.3μl，浓度为10mmol/l的dntps2μl，10×pcrbuffer5μl，浓度为40u/μl的rnasin0.6μl，浓度为200u/μl的m-mlv逆转录酶0.6μl，浓度为25mmol/l的mgcl2溶液5μl，添加无菌水至体积为50μl。其中，具有5'→3'外切活性的dna聚合酶可以为taq酶。

pcr扩增：将各反应管放入荧光定量pcr仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，选择要用的taqman荧光探针(本产品荧光报告基团为fam、hex、tat，荧光淬灭基团为eclipse)，定义样品孔，并按下表提供的扩增程序进行pcr扩增：

表1pcr扩增反应扩增程序

在扩增程序的第三步的终了读取荧光值。

nci-h498细胞pygo2基因pcr扩增图见图1，图中上、下两条线分别表示pygo2基因和内参β-actin基因pcr扩增曲线。nci-h498细胞foxm1基因pcr扩增图见图2，图中上、下两条线各表示foxm1基因和内参β-actin基因pcr扩增曲线。

五、westernblot实验

1)细胞样品的制备：

将细胞提取物使用500μlpbs清洗，清洗完成之后弃掉上清液。培养的细胞则需加入500μlpbs，并将细胞刮下重悬，转到ep管中，2,000rpm离心3min收集细胞。加入30μl细胞裂解液，1.5μl1.5mmdtt和1.5μl35×cocktail蛋白酶抑制剂，混匀后冰裕放置10min，并进行超声处理。4℃,12,000rpm离心5min后收集细胞裂解物。

2)样品蛋白浓度的测定：

首先配置bsa标准蛋白溶液，并制作标准曲线。分别将待测蛋白样品和标准蛋白按照1:1000的比例加入bio-rad蛋白染料工作液中，混匀后静置5min待其完全显色并于595nm测定吸光度，由此计算出待测样本的蛋白浓度。

3)上样及电泳：

在电泳槽中加入1×sds-page电泳缓冲液，在点样孔中加入5μl蛋白marker后，将制备好的样品5μl加入点样孔中。接通电源后将电压调整至70v，待蛋白样品准备进入分离胶后将电泳槽电压调至120v，等待10-15min后溴酚蓝染料将要跑到分离胶底部时停止。

4)转膜：

将跑好的page胶取出，取分离胶部分并同时准备相当大小的nc膜，同时往分离胶和nc膜中加入1×转膜缓冲液，并孵育10min。取6层滤纸将page胶和nc膜夹在其中，上面3层，下面3层，并用玻璃棒充分赶去其中的气泡，往转膜装置中加满转膜缓冲液，放置于4℃冰箱内。接通电源，160ma的恒流条件转膜2h。

5)免疫印迹：

以5％的脱脂奶粉为原料配成莫封闭液。等到转膜过程完成后，将nc膜取出后放入提前放入封闭液的培养皿中，并于20-25℃封闭1h。封闭结束后弃掉封闭液并将适量的一抗(1:1000)加入培养皿中，20-25℃孵育2h。孵育完成后使用pbs清洗nc膜，三次，每次5分钟。将适量的辣根过氧化物酶标记的二抗加入含nc膜的培养皿中，20-25℃孵育1h。完成后pbs清洗3次，每次20min。

6)显色与扫描：

将两种显色底物以1:1比例混合均匀制成显色液，nc膜用滤纸擦干，浸泡于显色液中，反应5min。显色完成后，立即置于生物发光仪中扫描膜上的目的条带。

六、数据分析判断：

检测结果计算：中位值(m)＝2^{-[(ct(样本hpygo2基因)-ct(样本β-actin基因))-(ct(对照hpygo2基因)-ct(对照β-actin基因))]}

当m≤1.4时，pygo2mrna为正常表达或者低表达；当m＞1.4时，pygo2mrna为过表达；

当m≤2.6时，foxm1mrna为正常表达或者低表达；当m＞2.6时，foxm1mrna为过表达。

图3给出了所有六种细胞中pygo2基因相对内参β-catenin的表达水平比较。

图4给出了所有六种细胞中foxm1基因相对内参β-catenin的表达水平比较。图5给出了所有六种细胞中pygo2蛋白和foxm1蛋白的表达情况。nc表示正常的结直肠黏膜细胞，从图中可见相对正常的结直肠黏膜细胞，六种结直肠癌细胞系中pygo2、foxm1基因以及蛋白均呈现不同程度的高表达。

以上实施例仅用来说明本发明的技术方案，而非对其进行限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110>湖北工业大学

<120>基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因表达的检测试剂

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggccctcggagaagttagga20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gccatctacgccgttttagtg21

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cacggcatcgtcaccaact19

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acagcctggatagcaacgtaca22

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cctgctctggtggagctgacaacctt26

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ctacaatgagctgcgtgtggctccc25