本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种分子信标检测人类mthfr基因多态性的试剂盒、方法及其应用。
背景技术：
mthfr基因是亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因，是叶酸代谢与甲硫氨酸代谢中的关键酶。mthfr蛋白可以使5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，从而作为甲基的间接供体参与体内嘌呤、嘧啶的合成及dna、rna、蛋白质的甲基化，同时维持体内正常的同型半胱氨酸水平。正常的mthfr活性才能维持叶酸甲硫氨酸循环的有效性，保证dna的合成和甲基化的正常进行。若mthfr酶活性发生变化，则导致5-甲基四氢叶酸生成障碍，引起dna合成和甲基化异常、高同型半胱氨酸血症而导致多种遗传性疾病的发生。
研究发现，mthfr677位点的多态性是影响该酶活性的一个重要因素，导致酶活性和热稳定性下降。mthfrc677t是一个常见的不耐热错义突变，其第677号密码子中的胞嘧啶(c)被胸腺嘧啶(t)代替。若以个体携带677cc基因型时其mthfr活性为100％，携带ct基因型的活性则为cc的71％，基因型为tt型的只有34％。据报道，mthfrc677t位点tt基因型个体的hcy水平较cc或ct基因型可升高约25％。低血浆叶酸浓度及维生素摄取不足会加重t等位基因相关风险。
通过对mthfr基因c677t位点检测，可以至直接发现被检测者叶酸代谢方面的遗传缺陷(即叶酸利用能力)，从而根据风险高低(相关代谢酶的活性程度)建议更准确的补充剂量。
目前针对多态性位点分析的方法主要有荧光定量pcr(qpcr)、pcr-限制性片段长度多态性(pcr-restrictionlengthpolymorphism，pcr-rflp)、扩增阻滞突变系统-pcr(amplificationrefractorymutationsystempcr，arms-pcr)等，但是由于这些方法操作步骤多，费时费力，或者需要pcr后处理，易产生污染，因此不适用于人群大规模的快速检测。测序法是核酸测序的金标准，虽然准确，但是操作步骤繁琐且成本较高。本发明，借助非对称pcr、分子信标技术和溶解曲线分析技术，发明了一种快速、准确的基因分型方法和试剂盒。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种分子信标检测人类mthfr基因多态性的试剂盒、方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种分子信标探针法检测人类mthfr基因多态性的引物，包括如下核酸序列：
(1)扩增mthfr基因rs1801133多态性位点的引物对，其核苷酸序列如seqidno.：1和seqidno.：2所示；
(2)用于检测mthfr基因rs1801133多态性位点的探针序列，其核苷酸序列如seqidno.：3所示，其中探针的5末端标记fam，3末端标记dabsyl。
上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。
上述分子信标探针法检测人类mthfr基因多态性的引物和探针在检测mthfr基因多态性中的应用在本发明的保护范围之内。
一种分子信标探针法用于检测人类mthfr基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针以及2xpcr反应混合液，阳性标准品。
一种分子信标探针法用于检测人类mthfr基因多态性的方法，包括如下步骤：
(1)提取人外周血基因组dna；
(2)分别以提取的人外周血基因组dna和阳性标准品为模板、权利要求1和2中的引物、探针、pcr反应混合液，进行实时荧光定量pcr反应；
(3)根据检测到的荧光信号值对rs1801133位点进行溶解曲线基因型判定，其中荧光通道选择fam通道，
进一步地，所述步骤(2)中，实时荧光定量pcr反应的扩增体系为：总体积20μl，2xpcr反应混合液10ul，seqidno.：10.02um，seqidno.：2，0.2um，seqidno.：30.2um，模板dna50ng。
更进一步地，所述步骤(2)中，实时荧光定量pcr反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，50个循环；溶解曲线分析程序为：95℃1min；45℃2分钟，45-90℃，连续收集荧光。
本发明提供了一种分子信标探针法检测人类mthfr基因多态性的引物和试剂盒，实现了对mthfr基因多态性位点进行快速、简单的检测。本发明检测结果准确，易于判读。与测序法相比，该方法不需要对pcr产物进行一系列复杂的后续处理，pcr扩增和检测同步进行，整个检测过程无需开盖操作，降低了pcr产物造成污染的风险，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。
附图说明
图1为不同基因型对应的检测结果图示。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
步骤1：dna提取
取200μl外周血，按照全血基因组dna提取试剂盒说明书进行dna提取(购自杭州新捷生物科技有限公司)，提取dna用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：pcr扩增和检测
(1)扩增mthfr基因rs1801133多态性位点的引物对，其核苷酸序列如seqidno.：1和seqidno.：2所示；
(2)用于检测mthfr基因rs1801133多态性位点的分子信标序列，其核苷酸序列如seqidno.：3所示，其中探针的5末端标记fam，3末端标记dabsyl。
在0.2ml中，配制如下反应体系：总体积20μl，2xpcr反应混合液10ul，seqidno.：10.02um，seqidno.：2，0.2um，seqidno.：30.02um，模板dna50ng。，加水补足至总体积20μl，同时设立阳性标准品和阴性对照。实时荧光定量pcr反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，50个循环；溶解曲线分析程序为：95℃1min；45℃2分钟，50-90℃，连续收集荧光。
步骤3：结果分析
反应结束后，应用仪器自带软件进行数据分析。运行溶解曲线基因型分析程序，进行基因型判读。
步骤4：结果统计
10例标本的基因型结果统计如下：
以上所述，是本发明较佳的实施例，并非本发明任何形式上或实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明的范围前提下，还可以对之做一些修改和改进，这些改进和补充也应该视为本发明的保护范围。
序列表
<110>北京迪安医学检验实验室有限公司
<120>一种分子信标探针法检测人类mthfr基因多态性的试剂盒、方法及其应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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