一种利用分子信标探针熔解曲线法同时检测MTHFR和MTRR基因多态性试剂盒及方法与流程

本发明属于基因检测
技术领域：
，具体涉及一种利用分子信标探针熔解曲线法同时检测mthfr和mtrr基因多态性试剂盒及方法。
背景技术：
：叶酸是b族维生素的一种，参与dna、rna、蛋白质等其他重要化合物的合成，在机体代谢过程中发挥重要的作用，常用于孕期营养补充，从而预防同型半胱氨酸血症和神经管缺陷等疾病。目前，经证实与叶酸代谢密切相关的基因有亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)和甲硫氨酸合成还原酶(mtrr)基因。mthfr和mtrr是叶酸代谢系统中的关键酶，其基因结构的改变，可导致叶酸代谢关键酶活性降低，影响核酸的生物合成。叶酸缺乏及其代谢障碍是胎儿发生神经管畸形(ntd)发生的主要病因之一。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，mthfr)在叶酸代谢、dna甲基化和dna合成等方面起重要作用，其基因多态性可导致叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，从而引发多种疾病，其中以高同型半胱氨酸血症引起的脑卒中以及新生儿缺陷最为严重。mthfr的活性很大程度上可能受基因多态性的影响，从而影响疾病的发生和药物的疗效。mthfr基因c677t和a1298c为两个常见的多态性位点，有研究表明该位点的基因多态性会导致mthfr酶活性的改变，可能导致患者之间出现较大的个体差异。mthfr基因异常的人，影响叶酸正常代谢，以及甲氨蝶呤、5-fu等药物的疗效和毒副作用，可能引起高同型半胱氨酸血症，导致凝血倾向增高，发生脑中风、冠心病以及静脉血栓的风险也增高。检测mthfr基因c677t的多态性能够用于临床指导5-fu类、甲氨蝶呤等个体化用药及育龄期妇女叶酸补充。甲硫氨酸合成还原酶(methioninesynthasereductase，mtrr)是维生素b12依赖性酶，在同型半胱氨酸再甲基化为met过程中发挥重要作用。研究发现，如果mtrr基因第66位密码子发生突变，将会导致酶活性发生变化，造成体内叶酸缺乏或同型半胱氨酸(hcy)水平升高，进而诱发多种疾病，如神经管疾病、心血管疾病等。通过对叶酸代谢相关的mthfr和mtrr基因位点多态性进行检测，可从分子水平上评估个体对叶酸的利用能力，从而可以根据风险高低(相关代谢酶的活性程度)进行个性化用药和指导。目前针对基因多态性位点分析的方法有很多，如荧光定量pcr法、基因芯片法、直接测序法、焦磷酸测序法、高分辨率熔解曲线法、pcr-限制性片段长度多态性(pcr-restrictionlengthpolymorphism，pcr-rflp)、扩增阻滞突变系统-pcr(amplificationrefractorymutationsystempcr，arms-pcr)等。传统荧光定量pcr法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。基因芯片法对仪器要求较高，且成本昂贵，不利于大规模推广。测序法虽然是基因多态性检测的金标准，但步骤多而繁琐，周期长，工作量大，且成本较高。高分辨率熔解曲线法受仪器温度控制，假阳性高。pcr-rflp法操作复杂，样本多时易造成pcr产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性的结果，可靠性低。技术实现要素：为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种采用不对称多重pcr、分子信标探针和熔解曲线技术检测mthfr(rs1801131和rs1801133)和mtrr(rs1801394)基因多态性试剂盒和方法。具有快速、简便、高灵敏度，高特异性，检测结果准确可靠，操作简单、通量高、成本低、无污染等优点。为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：一种分子信标探针熔解曲线法检测人mthfr和mtrr基因多态性的引物，包括如下核酸序列：(1)扩增mthfr基因(rs1801133,c677t)多态性位点的引物对，其核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示；(2)用于检测mthfr基因(rs1801133,c677t)多态性位点的分子信标探针序列，其核苷酸序列如seqidno.3所示，其中探针的5’末端标记荧光基团cy5，3’末端标记荧光淬灭基团dabsyl；(3)扩增mthfr基因(rs1801131，1298a/c)多态性位点的引物对，其核苷酸序列如seqidno.4和seqidno.5所示；(4)用于检测mthfr基因(rs1801131，1298a/c)多态性位点的分子信标探针序列，其核苷酸序列如seqidno.6所示，其中探针的5’末端标记荧光基团hex，3’末端标记荧光淬灭基团dabsyl；(5)扩增mtrr基因(rs1801394,66a/g)多态性位点的引物对，其核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示；(6)用于检测mtrr基因(rs1801394,66a/g)多态性位点的分子信标探针序列，其核苷酸序列如seqidno.9所示，其中探针的5’末端标记荧光基团fam，3’末端标记荧光淬灭基团dabsyl；上述引物对和荧光探针均在一次检测中共同使用。本发明还提供了一种利用分子信标探针熔解曲线法检测人mthfr和mtrr基因多态性的试剂盒，包括权利要求1所述的引物和分子信标探针。作为优选，所述试剂盒还包括2xpcr反应混合液、阳性对照、阴性对照和空白对照；所述2xpcr反应混合液中含有2xtaqdnapolymerase、2xpcr缓冲液、2xdntps；所述阳性对照中含有6种质粒dna，其中6种质粒dna中分别含有snp位点上rs1801131的a型基因和c型基因、rs1801133的c型基因和t型基因、rs1801394的a型基因和g型基因；所述阴性对照和空白对照为双蒸水。本发明还提供了一种分子信标探针熔解曲线法用于检测mthfr和mtrr基因多态性的方法，包括如下步骤：(1)提取人(外周血或口腔脱落细胞)基因组dna；(2)以提取好的人基因组dna为模板，利用权利要求1和2中的引物对、探针、2xpcr反应混合液，进行实时荧光定量pcr反应，其中，每个样品的mthfr和mtrr基因多态性检测在同一管中进行实时荧光定量pcr反应。进一步地，所述荧光定量pcr反应体系为：进一步地，所述荧光定量pcr反应的扩增程序为：95℃预变性2min，预变性后按照以下程序进行30个循环：95℃，15s，60℃，30s，收集荧光信号；然后按照以下程序进行熔解曲线分析：95℃预变性1min；45℃1s，然后以0.04℃/s的速度从45℃升温至85℃收集熔解曲线数据，然后根据特定熔解峰判定rs1801133、rs1801131和rs1801394位点基因型，其中荧光通道分别选择cy5、hex和fam通道。本发明的人mthfr和mtrr基因多态性检测试剂盒采用不对称多重荧光定量pcr、分子信标探针和熔解曲线技术，建立了在同一反应管中同时加入3对特异性基因扩增引物及3条5’末端标记不同荧光基团的分子信标探针，根据不同基因扩增片段与分子信标探针结合在不同荧光通道产生不同位置的熔解曲线峰分析多个基因多态性位点及基因型，能快速有效地检测多个基因多态性位点。另外本发明人mthfr和mtrr基因多态性检测试剂盒采用特异性引物扩增目的模板与分子信标探针特异性检测目的模板方法，对特异性检测同一基因不同基因多态性提供双重保证，同时加入阴性对照和空白对照，最大程度地降低假阳性产生，能更加准确、稳定地对样品进行多态性检测。本发明的试剂盒具有以下优点：1.通量高：一次可以检测93个标本。2.灵敏度高：可以准确检测出低至1ng的基因组dna；对于保存时间过长以及口腔拭子这些提取浓度很低的样本均能准确检出。3.特异性强：针对mthfr和mtrr的基因型设计特异性引物和特异性分子信标探针，可以特异性扩增识别对应的基因多态性。4.使用荧光定量pcr和熔解曲线技术同步进行扩增和检测，无需进行后续开盖加样及后期处理，操作更简单，避免了开盖气溶胶污染引起的假阳性。5.在同一反应管中可同时检测三种基因的多态性，操作简便，结果直观，一目了然。6.适用于多种样本类型：本发明不仅能检测常规的edta抗凝的全血dna，还能检测提取质量差的口腔拭子dna，还可以直接检测全血细胞裂解红细胞后的白细胞dna，检测结果准确度高。7.成本低，分子信标探针熔解曲线法，不仅能保留熔解曲线的高分辨率，分子信标探针的高灵敏度和高特异性，而且还能节约成本。8.检测速度快，整个检测过程只需要60分钟。9.安全：整个试剂盒不包含有毒有害物质，对操作人员和环境无危害。总之，本发明涉及的mthfr和mtrr基因多态性检测试剂盒适用于临床多种类型样本的检测，具有通量高，灵敏度高，特异性强，实验周期短，操作简单，安全环保，成本低等显著优点。应用本发明的检测方法能快速实现对人类mthfr(rs1801131和rs1801133)和mtrr(rs1801394)位点多态性的检测，可辅助医生对孕围产期新生儿神经管畸形、妊娠高血压病等疾病的发病风险进行评估，有效指导临床5-fu类个性化用药，能够做到早期发现、早期纠正高hcy血症；同时，为育龄期妇女补充叶酸提供基因依据。附图说明图1为mthfr(rs1801133,677c/t)c/c纯合野生样本检测结果；图2为mthfr(rs1801133,677c/t)t/t纯合突变样本检测结果；图3为mthfr(rs1801133,677c/t)c/t杂合突变样本检测结果；图4为mthfr(rs1801131,1298a/c)a/a纯合野生样本检测结果；图5为mthfr(rs1801131,1298a/c)a/c杂合突变样本检测结果；图6为mtrr(rs1801394,66a/g)a/a纯合野生样本检测结果；图7为mtrr(rs1801394,66a/g)a/g杂合突变样本检测结果；图8为阴性对照/空白对照检测结果。具体实施方式为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但所举实施例不作为对本发明的限定。本发明的一个方面提供了同时检测人类mthfr和mtrr基因多态性的特异性引物和分子信标探针序列，其中，所述特异性引物和分子信标探针序列的核苷酸序列如seqidno.1-9所示。其中，seqidno.1与seqidno.2、seqidno.4与seqidno.5、seqidno.7与seqidno.8为普通pcr引物，分别扩增包含mthfr677、mthfr1298、mtrr66基因多态性位点的dna片段；其中seqidno.3、seqidno.6、seqidno.9为分子信标探针，用于分别特异性结合含有mthfr677、mthfr1298、mtrr66三个位点特异性的dna片段。3条分子信标探针分别在5’末端标记荧光基团cy5、hex和fam，同时在其3’末端标记荧光淬灭基团dabsyl。本发明还提供了一种用于同时检测人类mthfr和mtrr基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1所述的特异性引物和分子信标探针序列。本发明的检测试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和空白对照，设置阳性对照和空白对照可监测实时荧光定量pcr反应的正常进行，阳性对照用于监测荧光定量pcr扩增是否正常，空白对照用于监测反应液配制过程中是否无交叉污染，设置阴性对照可监测从核酸提取到荧光定量pcr反应过程的正常进行，保证核酸提取过程中无交叉污染；所述阳性对照液中含有本发明中涉及的mthfr基因两种多态性mthfr677、mthfr1298，mtrr基因一种多态性mtrr66的6种质粒dna混合液，该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这6种质粒浓度相同，均为103copies/μl；所述阴性对照和空白对照为双蒸水，阴性对照需作为样本进行核酸抽提。本发明的另一个技术方案为一种同时检测人类mthfr和mtrr基因多态性的方法，该法包括以下步骤：(1)提取人(外周血或口腔脱落细胞)基因组dna；(2)利用所述特异性引物对、分子信标探针、2xpcr反应缓冲液进行荧光定量pcr反应，其中，每个样品的mthfr基因多态性和mtrr基因多态性检测在同一反应管中进行pcr反应。以20μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：上述体系仅为例证，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其各组分含量。具体地，所述荧光定量pcr反应的程序为：95℃预变性2min，预变性后按照以下程序进行30个循环：95℃，15s，60℃，30s，收集荧光信号；然后按照以下程序进行熔解曲线分析：95℃预变性1min；45℃1s，然后以0.04℃/s的速度从45℃升温至85℃收集熔解曲线数据。在上述反应结束后，按表1进行结果判定：表1.结果判定本发明的检测方法具有通量高、灵敏度高、特异性强、结果准确可靠等优点，同时该检测方法操作简单快速，能在60分钟内完成检测，并且结果判读直观明确，一目了然。以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。实施例1制备本发明的mthfr和mtrr基因多态性检测试剂盒，包括以下步骤：1.引物及探针合成：设计并合成3对特异性引物seqidno:1、seqidno:2；seqidno:4、seqidno:5；seqidno:7、seqidno:8；3条分子信标探针seqidno:3、seqidno:6；seqidno:9，并在seqidno:3的5’端标记cy5荧光基团，3’端标记dabsyl不发光淬灭基团，seqidno:6的5’端标记hex荧光基团，3’端标记dabsyl不发光淬灭基团，seqidno:9的5’端标记fam荧光基团，3’端标记dabsyl不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100μm的母液储存。2.制备阳性对照，该阳性对照中含有6种质粒dna，这些质粒dna中分别含有本发明试剂盒涉及的mthfr677c、mthfr677t、mthfr1298a、mthfr1298c、mthfr66a、mthfr66g基因6种不同的多态性dna片段，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为103copies/μl。3.pcr反应液配制：按照下表进行不同体系pcr反应液配制2xpcr反应混合液10μlseqidno.120～100nmol/lseqidno.2100～500nmol/lseqidno.320～100nmol/lseqidno.450～200nmol/lseqidno.5250～1000nmol/lseqidno.620～100nmol/lseqidno.750～200nmol/lseqidno.8250～1000nmol/lseqidno.920～100nmol/l加双蒸水至18μl4.组装试剂盒：试剂盒中包含1管检测mthfr和mtrr基因多态性检测pcr反应液，1管阴性对照(双蒸水)，1管空白对照(双蒸水)和1管阳性对照；根据pcr反应体系各成分使用量，计算20人份和96人份两种规格各成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。实施例2：用实施例1制备的人mthfr和mtrr基因多态性检测试剂盒对待测样品进行检测。本实施例中收集20例叶酸代谢障碍的抗凝全血样品，从其中提取基因组dna，用实施例1中得到的人mthfr和mtrr基因多态性检测试剂盒检测待检样品的mthfr和mtrr的基因多态性情况。1：人全血基因组dna的提取(自配试剂)1)取全血200μl，加入20μlproteinasek(20mg/ml)溶液，混匀，再加入300μl裂解液bl，充分震荡混匀，56℃水浴10min。2)加入260μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。3)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入2ml收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。4)向吸附柱中加入500μl洗涤缓冲液w1(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。5)向吸附柱中加入600μl洗涤缓冲液w2(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。6)向吸附柱中加入600μl洗涤缓冲液w3(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。7)14,000rpm离心1min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。8)将吸附柱转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。9)取2μl所得溶液用nanodrop分光光度计测定dna浓度，然后将样品dna稀释到2～50ng/μl，分别取2μl加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的pcr反应。提取的dna长时间不用应存放于-20℃。注：阴性对照需作为样本进行以上核酸提取步骤。2：不对称多重荧光定量pcr扩增和检测将步骤1中稀释后的dna样品和阴性对照依次取2μl分别加入到18μl的实施例1的试剂盒的检测反应体系中，使反应体系总体积为20μl，瞬时低速离心后，将反应板放入荧光定量pcr仪中，按如下所示设置pcr反应程序后进行扩增反应：95℃，2min；95℃，15s，60℃，30s，30个循环；每个循环后收集cy5、hex和fam的荧光信号。然后按照以下程序进行熔解曲线分析：95℃预变性1min；45℃1s，然后以0.04℃/s的速度从45℃升温至85℃收集熔解曲线数据，然后根据特定熔解峰判定rs1801133、rs1801131和rs1801394位点的基因型。3.样本的检测结果分析：mthfr677c/c纯合野生样本2例，其中一个检测结果如图1所示；mthfr677t/t纯合野生样本3例，其中一个检测结果如图2所示；mthfr677c/t杂合突变样本2例，其中一个检测结果如图3所示；mthfr1298a/a纯合野生样本4例，其中一个检测结果如图4所示；mthfr1298a/c杂合突变样本3例，其中一个检测结果如图5所示；mtrr66a/a纯合野生样本4例，其中一个检测结果如图6所示；mtrr66a/g杂合突变样本2例，其中一个检测结果如图7所示；阴性对照和空白对照，其中一个检测结果如图8所示。上述20例样本荧光定量pcr检测结果与直接测序结果完全一致。以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人mthfr和mtrr基因多态性的检测结果可靠，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本
技术领域：
的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。序列表<110>沈阳迪安医学检验所有限公司<120>一种利用分子信标探针熔解曲线法同时检测mthfr和mtrr基因多态性试剂盒及方法<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctcgccttgaacaggtggag20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cggaagaatgtgtcagcctca21<210>3<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccggatctgtctgcgggagccgatttcatcgatccgg37<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gaaggactactacctcttctacctgaa27<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ctccagcatcactcactttgtgac24<210>6<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cgccacgaccagtgaagaaagtgtctttggtggcg35<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctgttacatgccttgaagtgatga24<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aacggctctaaccttatcggatt23<210>9<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cccgatgatcgcagaagaaatatgtgagcaagcatcggg39当前第1页12