一种抗体的抗原结合片段-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用与流程

文档序号：14543518阅读：599来源：国知局

本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种抗体的抗原结合片段-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。

背景技术：

抗体是分子量(～150kda)比较大的一类蛋白药物，难以透过血管内皮质及细胞间隙从而到达实体瘤深部的肿瘤细胞，因此到达肿瘤部位的抗体很少，sedlacek等的研究表明抗体只有注射剂量的0.01％到达肿瘤部位(sedlacekh-h,et.al,antibodiesascarriersofcytotoxicity,contributionstooncology,1992；43:1-145)，这方面极大的限制了全抗在实体瘤方面的应用。那么无论从经济成本还是安全性考虑全抗都显示其不足之处，因此对全抗的小型化改造已经成为一种趋势。

小型化抗体研究的初期主要的研究类型是单链的scfv及fab等，这类小型化抗体保留了全抗的亲和性和特异性，但是也显示其不足之处—半衰期较短，因此抗肿瘤效果并不是很理想。为了提高这类小型化抗体的抗肿瘤效果，一方面尝试融合蛋白片段(peg、fc、hsa等)改善其药动学性质(zhangh,et.al,therapeuticpotentialofananti-her2singlechainantibody–dm1conjugatesforthetreatmentofher2-positivecancer,signaltransductionandtargetedtherapy,17015(2017).)；另一方面尝试偶联小分子毒素药物，利用抗体的特异性，将毒素小分子靶向的运输到肿瘤部位，通过毒性小分子的抑制细胞dna或者蛋白合成、抑制细胞有丝分等作用特异性的杀伤肿瘤细胞。

抗体较长的半衰期主要是由于恒定区fc片段与细胞表面的fcrn的作用，因此fc片段常用于改造小型化抗体的药动学性质的(natalia,thecomingofageofengineeredmultivalentantibodies,biotechweek,2015,20(5):589-593.)。在s.dimitrov等人的研究中通过对igg型抗体的恒定区ch3片段进行氨基酸突变改造，突变后的ch3mut相比野生型的ch3显示出较强的对fcrn亲和性，是用于改善蛋白半衰期的另一选择(yingtl,et.al,engineeredsolublemonomericigg1ch3domain,journalofbiologicalchemistry,2013,288(35):25154-25164.)。

传统的化学偶联方法得到的抗体偶联药物的dar均一性差，体内代谢性质的评价比较困难，而且抗体的不均一性会造成其治疗窗较窄，治疗效果不佳。sortasea酶是一种表达在金黄色葡萄球菌中的膜蛋白，可以特异性的识别lpxtg多肽序列通过亲核加成作用将氨基端带有甘氨酸的分子/多肽、蛋白加成到蛋白末端(ton-thath,purificationandcharacterizationofsortase,thetranspeptidasethatcleavessurfaceproteinsofstaphylococcusaureusatthelpxtgmotif,procnatlacadsci.1999,96:12424-9.)。利用这个性质可以构建羧基端具有lpxtg的抗体，利用sortasea酶将氨基端含有甘氨酸的毒性小分子定点定量的偶联到抗体的羧基末端。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供了一种针对cd20的抗体的小型化抗体(只保留抗体的抗原结合片段)与海兔毒素(monomethylauristatine，mmae)偶联形成的抗原结合片段-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用，从而克服现有抗体偶联药物分子量太大而难以透过血管内皮质及细胞间隙从而到达实体瘤深部的肿瘤细胞的问题。

抗体-海兔毒素偶联药物既具有抗体对靶标的特异性亲和作用，又具有mmae对细胞的杀伤作用，在二者的协同作用下，可以将mmae定向的转运到肿瘤细胞，发挥特异性的抗肿瘤效果。

一种抗体的抗原结合片段-海兔毒素偶联物的制备方法，包括以下步骤：

(1)提供c端具有lpxtg序列的抗cd20单抗的抗原结合片段、具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物；

(2)在sortasea酶催化下，lpxtg序列与寡甘氨酸接头发生转肽反应，使所述抗原结合片段与具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物进行偶联；

(3)反应完成后，分离纯化得到所述抗原结合片段-海兔毒素偶联物。

所述抗原结合片段的重链c端连接有lpxtg序列。

所述抗原结合片段的重链lpxtg序列后还连接有组氨酸纯化标签。所述组氨酸纯化标签可以是6×his标签，在sortasea酶催化下lpxtg序列标签中苏氨酸(t)和甘氨酸(g)之间的肽键，形成共价硫代中间体，同时释放出甘氨酸及其羧基c末端肽段，所以组氨酸纯化标签在最终的抗原结合片段-海兔毒素偶联物中已经被切除，不影响偶联物的效果。

所述抗原结合片段的重链氨基酸序列如seqidno.1所示，轻链氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述抗原结合片段的重链氨基酸序列如seqidno.5所示，轻链氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述寡甘氨酸接头为ggg序列，所述寡甘氨酸接头与海兔毒素或海兔毒素衍生物之间设有缬氨酸-瓜氨酸二肽接头。缬氨酸-瓜氨酸二肽接头可在溶酶体酶cathepsinb作用下断开。

本发明又提供了所述制备方法制备的抗原结合片段-海兔毒素偶联物。

本发明还提供了所述的抗原结合片段-海兔毒素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括所述的抗原结合片段-海兔毒素偶联物。

所述肿瘤为cd20阳性的b细胞淋巴瘤。

本发明通过对抗cd20的单克隆抗体进行小型化试验，获取了抗体的抗原结合片段并与海兔毒素进行偶联，获得了dar均一性好的抗原结合片段-海兔毒素偶联药物，保留了全抗-海兔毒素偶联药物的特异性和亲和力，以及对cd20阳性肿瘤细胞的杀伤作用；并且具有较快的穿透肿瘤的速率及较高的在肿瘤部位的聚集量，是用于实体瘤治疗的一种非常有效的抗体偶联物形式。

附图说明

图1为fab-vcmmae酶促偶联反应紫外图谱。

图2为fab-ch3mut-vcmmae酶促偶联反应紫外图谱。

图3为亲和性检测结果图。

图4为体外活性检测结果图，其中图a、c、e使用细胞ramos，图b、d、f使用细胞daudi，图a和b检测fab和fab-vcmmae，图c和d检测fab-ch3mut和fab-ch3mut-vcmmae，图e和f检测ofa和ofa-vcmmae。

图5为细胞凋亡检测结果图，其中图a为fab，图b为fab-ch3mut，图c为ofa，图d为fab-vcmmae，图e为fab-ch3mut-vcmmae，图f为ofa-vcmmae，图g为图a～f的指示图。

图6为fab-cy5、fab-ch3mut-cy5裸鼠体内生物分布成像结果图。

图7为fab-vcmmae、fab-ch3mut-vcmmae体内抗肿瘤实验结果图。

具体实施方式

实施例1

sortasea的表达纯化包括：

(1)从金黄色葡萄球菌的基因组中pcr获得编码sortasea酶的基因序列，并在其n端加入his6标签，构建于表达载体pet28a中，通过大肠杆菌rosettaplyss2(de3)进行表达。将sortasea的表达菌株以1％的终浓度接种到1l的lb培养基中37℃摇床中180rpm培养约6h，待od值达到0.6左右时，加入1mmiptg于30℃进行诱导表达约12h。

(2)离心收集菌液，菌液溶于150mmnah2po4，300mmnacl，用frenchpress(thermo)进行破壁，离心收集上清，过0.45μm孔径的水膜除菌，用histraphp(5ml，ge)柱进行纯化，洗脱流出液用10kdamillipore超滤管超滤浓缩并用50mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4缓冲液置换，-20℃保存。

实施例2

fab或fab-ch3mut单抗制备。

小型化的抗cd20抗体在ofatumumab(ofa)单抗的基础上改造的，ofa单抗能够特异性的结合cd20抗原分子，从而专一的杀伤b淋巴瘤细胞。

fab表示抗原结合片段，包括一条重链(h)和一条轻链(l)，重链氨基酸序列如seqidno.1所示，轻链氨基酸序列如seqidno.2所示，重链编码基因序列如seqidno.3所示，轻链编码基因序列如seqidno.4所示。在本发明中，fab还在原ofa单抗的抗原结合片段的基础上做了改造，用于与药物进行偶联，改造方式为在重链的ch1末端带有lpetgghhhhhh的多肽序列，lpetg为sortasea酶识别序列，6×his标签用于蛋白纯化。

fab-ch3mut表示在原ofa单抗的抗原结合片段的基础上，在重链ch1末端通过(ggggs)3连接头连接带有六个氨基酸突变(p243c、l251s、t266r、l268h、p295k、a331c)的ch3片段(命名为ch3mut)，然后在ch3mut的末端连接lpetgghhhhhh的多肽序列，改造后的fab-ch3mut的重链氨基酸序列如seqidno.5所示，轻链氨基酸序列如seqidno.2所示，重链编码基因序列如seqidno.6所示，轻链编码基因序列如seqidno.4所示。

ofa单抗的抗原结合片段的轻链和重链编码基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成(由发明人前期实验时合成，详见申请号为zl201310046396.9的中国发明专利)，然后用pcr方法完成上述改造。然后分别连接pmh3表达载体并瞬转至人胚肾细胞(293f)中，并用histraphp亲和柱对抗体进行纯化，并获得fab或fab-ch3mut单抗。

实施例3

fab-vcmmae和fab-ch3mut-vcmmae偶联物的制备。偶联反应发生的原理是sortasea酶进攻抗体末端的lpetg片段，特异性的切断氨基酸残基t与g，将ggg-vcmmae亲和加成到lpet的末端通过脱水缩合形成肽键，最终形成本发明所述的fab-vcmmae和fab-ch3mut-vcmmae偶联物。

fab-vcmmae，fab-ch3mut-vcmmae偶联物的制备方法：

(1)在10ml反应体系中，分别加入6μmfab或fab-ch3mut单抗(溶于50mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)，用缓冲液(50mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)溶解的300μmggg-vcmmae(由南京联宁生物技术有限公司合成，ggg-vcmmae中，ggg表示三个甘氨酸残基，vc表示溶酶体酶cathepsinb可断开的二肽接头(缬氨酸-瓜氨酸)，mmae为高毒性小分子药物海兔毒素。)，50mμsortasea，5mm的cacl2，于37℃水浴反应12h。

(2)用proteinl(1ml，ge)柱用来纯化反应液，洗脱液洗脱得到抗体偶联物，用1mtris调ph至7.0左右，10kdamillipore超滤管超滤浓缩并用pbs缓冲液置换，-20℃保存备用。

(3)hplc分析fab-vcmmae偶联效率，如图1所示fab的轻链(l)重链(h)，此外还有sortasea(srt)及ggg-vcmmae(m)的峰。重链偶联上ggg-vcmmae后出峰时间推迟标记为h1(表示重链上连上一个mmae)，从峰面积分析酶促偶联的效率可以到达85％左右。同样的图2所示为fab-ch3mut-vcmmae偶联效率紫外图谱，分析结果显示其偶联效率也可以达到85％左右。

实施例4

流式细胞仪检测fab-vcmmae及fab-ch3mut-vcmmae偶联物的亲和力。

(1)收集1×10⁶个daudi细胞(cd20阳性)同10μg/ml的fab-vcmmae，fab-ch3mut-vcmmae及ofa-vcmmae在4℃共孵育30min。

(2)pbs洗涤三次后，每管加入抗人的鼠单抗fab(1∶1500稀释)200μl，并于4℃孵育30min。

(3)pbs洗涤三次后，每管加入fitc标记的山羊抗鼠的igg(h+l)(1∶250稀释)200μl，4℃孵育30min后，pbs洗涤3次，用流式细胞仪检测。

(4)流式细胞仪检测抗体偶联物与cd20阳性细胞的亲和力主要通过二抗标记后的fitc的平均荧光强度来表示。

(5)如图3显示fab-vcmmae及fab-ch3mut-vcmmae和全抗ofa-vcmmae相比亲和力略有下降但基本上保留了全抗的亲和性。

实施例5

fab-vcmmae及fab-ch3mut-vcmmae偶联物的体外活性测定。

(1)收集cd20阳性的细胞ramos和daudi，计数后用rpmi-1640(10％fbs)培养基分别以3000cell/孔的细胞量和100μl/孔的培养基量铺板；

(2)加入不同浓度的fab，fab-ch3mut，fab-vcmmae及fab-ch3mut-vcmmae稀释液100μl/孔，每个浓度平行三份，37℃，5％co2培养箱中培养4天；

(3)每孔中加入50μl25％cck(空白的rpmi-1640培养基稀释)，37℃，5％co2培养箱中培养2～4h，用酶标仪检测450nmod值。利用graphpadprism软件计算抗体偶联物的ic50值；

(4)图4结果显示fab-vcmmae及fab-ch3mut-vcmmae和fab及fab-ch3mut相比对cd20阳性细胞的杀伤力都有明显的提高，其中fab-vcmmae和ofa-vcmmae的ic50相差不大，fab-ch3mut-vcmmae相比fab-vcmmae和ofa-vcmmaeic50至约低了5～10倍。

实施例6

细胞凋亡测定。

收集ramos细胞以1×10⁵cell/ml的量铺板于六孔板中，共孵育20nmfab、fab-ch3mut、ofa、fab-vcmmae、fab-ch3mut-vcmmae和ofa-vcmmae，48h后细胞离心去培养基，用pbs洗涤后，用100μl含有5μlannexinv、5μlpi重悬，室温孵育15min，补加400μl的结合液，流式细胞仪检测细胞凋亡百分比。

从图5的结果中可以看出fab、fab-ch3mut、ofa对细胞的杀伤作用很弱，三者的凋亡率和空白组基本一致，但是fab-vcmmae、fab-ch3mut-vcmmae诱导细胞凋亡的现象非常明显，早调/晚调分别为24.2％/23.7％，15.4％/20.9％和ofa-vcmmae21.8％/30.4％相差不大。

实施例7

体内生物分布测定。

(1)fab/fab-ch3mut/ofa按照实施例3中的反应体系，偶联小分子ggg-(peg)3-n3(简称gpn，由南京联宁生物技术有限公司合成)；proteinl纯化偶联物fab-gpn/fab-ch3mut-gnp/ofa-gnp；

(2)fab-gpn/fab-ch3mut-gpn/ofa-gpn与等摩尔的dbco-cy5(lumiprobe，usa)在pbs缓冲液中室温反应过夜，用10kdamillipore超滤管避光超滤浓缩，并用pbs缓冲液置换，最终制备得到fab-cy5/fab-ch3mut-cy5/ofa-cy5，-20℃保存备用。

(3)体外培养cd20阳性细胞ramos，离心收集，并用pbs洗涤两次，计数后用一定体积的pbs重悬配置成7×10⁷cell/ml的细胞悬液；

(4)将细胞悬液按照每只7×10⁶cell的量接种于裸鼠(balb/cnud)左腋下皮肤，待裸鼠体内肿瘤平均大小为1000mm³时，对3只裸鼠分别以每只7nm的fab-cy5、fab-ch3mut-cy5、ofa-cy5尾静脉给药，分别在1.5h、4h、8h、12h、24h和48h用maestroinvivoimagingsystem仪器观察抗体药物在裸鼠体内的分布；

(5)如图6所示，fab-cy5在4h时在肿瘤部位有明显的聚集，而fab-ch3mut-cy5在约8h时有明显的聚集，ofa-cy5在24h才有明显的聚集，显而易见进入肿瘤部位的速率fab>fab-ch3mut>ofa；从肿瘤聚集量上来看，fab-ch3-cy5在8h有明显的聚集但是随着时间的延长聚集量略有减少，fab-cy5和ofa-cy5分别在12h和24h聚集量达到最大，但随着时间的延长二者聚集量并没有减少，所以fab与ofa和fab-ch3mut相比，兼具二者的优点，具有较快的穿透肿瘤的速率，并且在较长时间内能够保持较高的聚集量。

实施例8

体内抗肿瘤活性实验。

(1)体外培养cd20阳性细胞ramos，离心收集，并用pbs洗涤两次，计数后用一定体积的pbs重悬配置成7×10⁷cell/ml的细胞悬液；

(2)将细胞悬液按照每只7×10⁶cell的量接种于裸鼠(balb/cnud)左腋下皮肤，待裸鼠体内肿瘤平均大小为～100mm³时，将54只裸鼠分组为9组其中对照组两组pbs组，her2-fab-vcmmae(110nm/kg)；实验组七组：fab组(220nm/kg)，fab-ch3mut(220nm/kg)，fab-vcmmae(高220nm/kg，中110nm/kg，低55nm/kg)fab-ch3mut-vcmmae(110nm/kg)，ofa-vcmmae(220nm/kg)，每组6只。每三天尾静脉给药一次，共给药四次。停药后继续观察和测量裸鼠体重和瘤体积并记录数据。

(3)结果如图7所示，阳性对照组ofa-vcmmae在给药四次后，6只裸鼠瘤全部消失。fab-vcmmae高剂量组中6只有4只给药结束(～100mm³)后肿瘤消掉，其中有2只起始瘤比较大(～150mm³)给药结束后肿瘤仍在缓慢的长大。中剂量的fab-vcmmae组和fab-ch3mut-vcmmae组抑瘤效果不佳，和阴性对照组pbs及her2-vcmmae相比，肿瘤在不断的增长，但是增长的速度明显低于阴性组，其中fab-vcmmae110nm/kg抑制肿瘤的作用优于fab-ch3mut-vcmmae110nm/kg，用t-test进行分析p＝0.0488<0.05具有显著差异。说明fab-vcmmae在肿瘤治疗中优于fab-ch3mut-vcmmae，并且fab-vcmmae保留了全抗ofa-vcmmae的高效的抗肿瘤活性。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种抗体的抗原结合片段-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用

<160>10

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<213>人工序列(artificialsequence)

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serthrilesertrpasnserglyserileglytyralaaspserval

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