本发明领域属于药物合成领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性物质n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-苄氧基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑及其合成工艺。
背景技术：
酪氨酸激酶（tyrosinekinase）是在细胞中催化磷酸基团从atp中转移到蛋白质的酪氨酸残基上的酶，起到调控细胞中信号通路的“开”与“关”。酪氨酸的活性部位激酶各自具有一个结合位点的atp。由酪氨酸激酶催化的酶的酶活性是所述末端磷酸从atp转移至酪氨酸残基上的基片，称为蛋白酪氨酸磷酸化的一个过程。酪氨酸激酶的一些突变可使其一直处于“活跃”状态，能引起细胞的不受抑制的生长，最终演变为癌症。因此一些酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼等被作为抗癌药物研发出来，并具有良好的市场前景。
k252a是从诺卡氏菌物种（nocardiopsisspecies）中分离的吲哚咔唑生物碱，其显示出对蛋白激酶c和环核苷酸依赖性蛋白激酶的有效抑制活性。最近，已经发现k252a也是体外trk酪氨酸激酶活性的有效抑制剂。然而，小鼠实验表明，k252a缺乏抗肿瘤活性。
在k252a分子结构的基础上，运用生物电子等排、优势结构变换以及骨架跃迁等，设计并合成具有trk抑制效果的类似物。化合物n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-苄氧基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑具有抑制肿瘤细胞中trk酪氨酸激酶活性的作用，有很大的药学应用前景。
技术实现要素：
本发明所述的化合物n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-苄氧基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑在体中的抗肿瘤活性。
本发明还提供了一种快速简洁的制备n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-苄氧基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑的方法。本发明采用如下的路线合成具有抗肿瘤活性物质n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-苄氧基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑。
n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-羟基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑2的合成条件为：
将n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-氧代-二氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑1、添加剂（2.0-3.0当量）和溶剂s1（1-10倍）混合，氮气保护下，于-40-0℃下搅拌30-60分钟，向体系中加入异丙基溴化镁（2.0-3.0当量），搅拌10-16小时，向体系中加入饱和氯化铵溶液和乙酸乙酯，分液得到有机相，有机相浓缩，加入溶剂s2（1-10倍），升温至50-70℃，搅拌1-3小时，降温至0-10℃，析晶2-6小时，过滤得到n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-羟基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑2。
添加剂选自add-1、add-2、add-3、add-4或add-5；优选的添加剂是add-2、add-4或add-5；最优选的添加剂是add-4；其结构如下所示：
溶剂s1选自乙醚、正己烷、正庚烷、甲苯、二氧六环或四氢呋喃；优选的溶剂是乙醚、二氧六环或四氢呋喃；最优选的溶剂是四氢呋喃。
溶剂s2选自甲醇、乙醇、异丙醇、水或其混合溶剂；优选的溶剂是混合溶剂；最优选的溶剂是甲醇与水的混合溶剂。
n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-苄氧基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑的合成条件为：
将n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-羟基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑2、碱（1.5-3.0当量）和溶剂s3（1-20倍）混合，于0-20℃下搅拌10–60分钟，向体系中加入苄溴（1.0-2.0当量），搅拌1-5小时，向体系中加入溶剂s4（1-20倍），搅拌1-3小时，过滤得到化合物n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-苄氧基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑。
碱选自碳酸钾、氢氧化钾、nah、三乙胺或二异丙基乙基胺；优选的碱是碳酸钾、nah或氢氧化钾；最优选的碱是氢氧化钾。
溶剂s3选自二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或n-甲基吡咯烷酮；优选的溶剂是二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺。
溶剂s4选自甲醇、乙醇、异丙醇或水；最优选的溶剂是水。
本发明所用的合成条件和方法，一方面可以提高目标产物的产率和手性纯度，另一方面大大简化工艺操作，缩短了生产周期，为后续药学试验提供大量的n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-苄氧基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-羟基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑2的合成方法
将n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-氧代-二氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑1（76.5g）、add-4（200.5g）和四氢呋喃（750ml）混合，氮气保护下，于-40-0℃下搅拌40分钟，向体系中加入异丙基溴化镁（1minether，400ml），搅拌12小时。向体系中加入饱和氯化铵溶液（10l）和乙酸乙酯（15l），分液得到有机相，有机相浓缩，加入甲醇与水的混合溶剂（v/v=1:1，7.5l），升温至60℃，搅拌1.5小时，降温至0-10℃，析晶5小时，过滤得到浅黄色固体（76.2g，90％），即为n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-羟基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑2，hplc纯度97％，手性纯度95%（保留时间:9.28min.）;mp252-257°c;ir(kbr):ν1735,1680,1460,1395,1315,1272cm-1;1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ=0.93(d,6h),1.63(s,3h),1.70(m,1h),2.12(dd,1h),2.34(dd,1h),4.95(t,1h),6.24(brs,1h),7.37(m,2h),7.45(d,2h),7.64(d,2h),7.82(s,1h),8.19(d,2h)ppm;13cnmr(100mhz,dmso-d6):δ=153.7,150.0,140.1,136.5,110.8,120.5,109.6,124.4,125.4,121.4,140.6,121.7,119.8,85.0,64.5,61.5,35.8,27.2,17.5,17.0ppm;m/z(ms-esi):454.56[m+1]+.
实施例2
n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-苄氧基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑的合成方法
将n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-羟基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑2（70.2g）、氢氧化钾（17.4g）和二甲基甲酰胺（150ml）混合，于10℃下搅拌40分钟，向体系中加入苄溴（40.0g），搅拌4小时，向体系中加入水（300ml），搅拌2小时，过滤得到浅黄色固体（77.9g,92%），即为化合物n,n’-[(2’s,3’s)-2’-甲基-3’-苄氧基-3’-异丙基四氢噻吩]-12,13-吲哚并[2,3-a]恶唑并[4,5-c]咔唑。hplc纯度99％，手性纯度96%，（保留时间：7.35min.）;mp:230-243℃;ir(kbr):ν3412,3063,2837,1668,1587,1458,1123cm-1;1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ=0.92(d,6h),1.64(s,3h),1.71(m,1h),2.12(dd,1h),2.34(dd,1h),4.68(s,2h),4.95(t,1h),7.28-7.35(m,6h),7.45(d,2h),7.64(d,2h),7.82(s,1h),8.19(d,2h)ppm;13cnmr(100mhz,dmso-d6):δ=153.7,150.0,140.1,136.5,110.8,120.5,128.8,109.6,124.4,125.4,121.4,140.6,121.7,119.8,127.4,128.6,127.8,85.0,64.5,61.5,35.8,27.2,17.5,17.0ppm;m/z(ms-esi):544.69[m+1]+.
生物活性测定
实施例3激酶试验-生化trka，trkb和trkc抑制:
trka和trkc生化检测由htrf法进行。反应混合物包含1μm多肽底物，1μmatp，和1.8nmtrka或34nmtrkc反应缓冲液(50mmhepesph7.1，10mmmgcl2，2mmmncl2，0.01%bsa，2.5mmdtt和0.1mmna3vo4)，最终体积为10微升。所有反应于室温下在白色proxiplate™384孔正极板上进行，60分钟时用5微升0.2mmedta淬灭反应。加入5微升检测试剂(每孔2.5ngpt66k和0.05μgsaxl)，板在室温下培养1小时，然后在envision阅读器上读取。将化合物在测试混合物中(终dmso0.5%)稀释，确定ic50值。
trkb的生物化学测定通过卡尺微流体法进行。反应混合物包括1μm多肽底物，10μmatp，和2nmtrkb的反应缓冲液，缓冲液包含100mmhepes，ph7.5，5mmmgcl2，0.01%tritonx-100，0.1%bsa，1mmdtt，10μna3vo4，和10μμbeta-甘油磷酸盐。反应在室温下进行3小时，产物由caliperez阅读器测定。化合物在测试混合物(终dmso1%)中稀释，确定ic50值。