MicroRNA744(MIR744)核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）的制作方法

本发明属于生物技术人领域，为通过逆转录（rt）rna样品得到cdna，现结合实时荧光定量pcr技术，可以精确定量检测标本中人microrna744(mir744)表达量的试剂盒。
背景技术：
：据中国肿瘤登记中心的数据显示，2015年中国新增430万癌症病例，癌症死亡病例超过281万，占据全年死亡人数比例的28.82%，居于世界首位，即平均每天就有超过7500人死于癌症。胰腺癌的发病率在美国1988年时为9/10万，男女比例为1.3：1。多见于45岁以上者。瑞典发病率较高，为125/10万，并且在过去20年里保持不变。英国和挪威各增加了1倍。70年代与60年代相比，加拿大、丹麦和波兰的标化发病率增加了50%以上。在我国，胰腺癌已成为我国人口死亡的十大恶性肿瘤之一。根据北京地区7家医院354例病例分析，病人中41～70岁者占80%，年轻的胰腺癌病人也较10年前有明显增加的趋势，而且恶性度更高，愈后更差。就胰腺癌的发生部位而言，仍以胰头部位最多见，约占70%左右，胰体次之，胰尾部更次之，有的头体尾部均有，属于弥漫性病变或多中心性病变。现今，胰腺癌是已成为人类健康的重大威胁。目前，手术切除、化疗、放疗及内分泌治疗依然是胰腺癌治疗的主要方法。在上述技术已经达到相当成熟和普及的同时，高复发和转移率也依然是胰腺癌患者面临的主要问题，这些问题的出现对患者的有效生存期起着重要的影响，严重危害着肿瘤患者术后的生活质量。那么如何在患者术后检测其肿瘤的复发和转移成了众多学者的研究课题。2000年以后，很多学者都在研究将分子生物学领域应用到人类健康课题上来，至今已经十几年，由此而发展的体外检测技术也在不断成熟和完善中。其中taqman荧光定量pcr就是其中的一种体外诊断技术。由于taqman荧光定量pcr具有重复性好，结果准确可靠的特点，所以在医学检测方面，一些常规检测方法所不能解决的问题可以以此解决。一般来说细胞形态学检查可直接观测到肿瘤细胞，但仅限于组织的病理检测。由于肿瘤脱落至血循环中的数目微小，这种检查的敏感性和特异性均较差，阳性率仅为1%。后期的免疫组织化学方法提高了检出率，但该技术生产复杂，且需要特异性的抗体，而且假阳性率也高。taqman荧光定量pcr与这些技术相比，有着明显的优点，由于有些肿瘤可转录特异性mrna，但无相应蛋白合成，故荧光定量pcr应用范围较蛋白广泛；另外只要知道待测基因序列，即可设计合成引物探针进行逆转录及扩增，操作方便；同时该方法具有较高的灵敏度及可重复性，保证了医学检测结果的准确性。以microrna744(mir744)检测为例，microrna744(mir744)是胰腺癌的特异性的生物标志物，在健康人外周血中含量很低或检测不到microrna744(mir744)，而在复发和转移的胰腺癌患者中，如果癌细胞脱落于血液中，在血清或血浆中就会产生microrna744(mir744)，便可以检测到。与此同时，taqman荧光定量pcr技术具有很好的灵敏性和特异性，有针对性的对胰腺癌患者外周血及肿瘤组织﹑骨髓等样本中的microrna744(mir744)的表达进行检测，便可以对胰腺癌细胞血行播散等诊断提供重要的依据。所以该技术的应用，将会对早期胰腺癌患者的诊断、指导临床治疗、改善患者预后产生极为重要的作用。技术实现要素：本发明为一种microrna744(mir744)核酸定量检测试剂盒（pcr-荧光探针法），含有4种组分，分别为：一步法rt-pcr反应液（360μl/管），阳性对照品（50μl/管）、阴性对照品（50μl/管）、2×106copies/µl标准品（20μl/管）主要成份组成。一步法rt-pcr反应液中含有depc处理的水、逆转录酶、taq酶、dntps、rt-pcr缓冲液、寡聚（dt）15-18、mgcl2（3mm）、检测用上游引物（0.2μm）、检测用下游引物（0.2μm）、荧光探针（0.3μm），其中：检测用上游引物序列为：5’—ttgggcaaggtgcggggctagg—3’；检测用下游引物序列为：5’—gaccgagtaaggttgaggttag—3’；荧光探针序列：5’—fam—gcaacagcatgtgcgtggtttc—tamra—3’；标准品序列为：ttgggcaaggtgcggggctagggctaacagcagtcttactgaaggtttcctggaaaccacgcacatgctgttgccactaacctcaaccttactcggtc。质控品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为有microrna744(mir744)的rna样品，阴性对照品为microrna744(mir744)的rna样品。2×106copies/µl标准品为含有标准扩增序列的质粒。本试剂盒-20℃冷冻保存，有效期为6个月，应避免反复冻融。本发明建立了利用taqman技术检测microrna744(mir744)的方法，并经检测患者标本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了实时荧光pcr扩增技术，对从新鲜人外周血清中提取出总rna并进行逆转录，再用microrna744(mir744)的特异性引物及特异性荧光探针，配以pcr缓冲液、耐热dna聚合酶（taq酶）、四种核苷酸单体（dgtp、datp、dctp、dttp）等成分，应用实时荧光pcr技术检测人外周血清中microrna744(mir744)核酸的表达量，对原发性胰腺癌患者的肿瘤细胞是否存在血行播散提供重要的依据。本发明试剂盒的使用方法：每次检测应设立阳性和阴性对照。一．实验准备提取人外周血清中总rna（使用市面上常用的血清microrna提取试剂盒），-20℃保存备用。二．rt-pcrrna预变性：将总rna溶液置于70℃水浴中保温5分钟，取出后迅速放置冰上，备用。按表1配制反转录体系：表1反转录体系一步法rt-pcr反应液20μl模板总rna溶液5.0μl将pcr反应管放入仪器样品槽（仪器具体操作方法按照各自的使用说明书进行）。rt-pcr反应条件：1）40℃30分钟；2）95℃5分钟；3）95℃15秒→60℃1分钟，45个循环。三、标准品及对照品的扩增取2×106copies/µl标准品10µl，用去离子水梯度稀释为2×105，2×104，2×103，2×102，2×101copies/µl，连同2×106copies/µl标准品共6个浓度，各取5µl为模板(其他组分同表1)同待测样本一同进行pcr扩增，以便绘制标准曲线。四、结果判定：本试剂盒的阳性判断的临界值为102copies/ml血清。附图说明：图1为实时荧光定量rt-pcr标准品检测图2为实时荧光定量rt-pcr标准曲线具体实施方式本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，应该理解这些实施例仅用于说明目的，而不限制本发明范围。实施例1microrna744(mir744)核酸定量检测试剂盒（pcr-荧光探针法）检测microrna21的表达的应用一．材料：试剂盒组分材料来源：一步法rt-pcr反应液中的rt-pcr缓冲液成分购自takara公司，检测探针，引物由takara公司合成；depc处理的水为自制；2×106copies/µl标准品为有目的片段的质粒溶液；阳性对照品为有microrna744(mir744)的rna样品，阴性对照品为无microrna744(mir744)的rna样品。二、仪器设备：abi7300荧光定量pcr仪。三、引物和探针设计和合成：以microrna744(mir744)序列（genbank登录号：nr-030613.1）为模板，使用abi7300型实时荧光定量pcr仪随机软件分析taqman引物和探针位点，同时考虑基因组dna序列情况，从中选择最佳组合。引物和探针由takara公司合成。标准品溶液中的含目的基因的重组质粒由上海生工生物合成。检测用上游引物序列为：5’—ttgggcaaggtgcggggctagg—3’；检测用下游引物序列为：5’—gaccgagtaaggttgaggttag—3’；荧光探针序列：5’—fam—gcaacagcatgtgcgtggtttc—tamra—3’。四、标准品制备标准品由上海生工合成，然后用克隆系统插入pcr2.1克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。ecorⅰ酶切后回收即为标准品，测定浓度并换算成（拷贝数/体积）。五、实验结果经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下（包括两端ecorⅰ位点）：gaattcttgggcaaggtgcggggctagggctaacagcagtcttactgaaggtttcctggaaaccacgcacatgctgttgccactaacctcaaccttactcggtcgaattc。实施例2microrna744(mir744)核酸定量检测试剂盒（pcr-荧光探针法）的临床应用一、样本来源52例经病理诊断为胰腺癌患者为实验组，其中42例为病理诊断已发生淋巴结或远端转移，10例为病理诊断未发生淋巴结或远端转移；20例健康人和30例胰腺炎疾病为对照组。二、样本检测:每例受试者取1ml血清为标本，经适当的方法，抽提取标本中的rna。应用本发明的试剂进行荧光定量rt-pcr扩增，rt-pcr反应条件：1）40℃30分钟；2）95℃5分钟；3）95℃15秒→60℃1分钟，45个循环。同时加标准品和阴、阳性对照品，标准品用于制作标准曲线。结果经仪器处理后根据标准曲线计算出检测标本microrna744(mir744)的含量。三、样本检测结果标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2。表2102例临床病例microrna744(mir744)拷贝数检测结果实验结果表明：实验组52例胰腺癌患者的血清检测结果阳性率达到90%以上，而对照组20例健康人和30例胰腺炎患者中除2例胰腺炎患者检测阳性外，其余均检测为阴性。上述结果表明本发明的试剂盒可以对microrna744(mir744)的量进行较为准确的定性和定量分析。ttgggcaaggtgcggggctagggctaacagcagtcttactgaaggtttcctggaaaccacgcacatgctgttgccactaacctcaaccttactcggtc当前第1页12