TFEB作为脑卒中生物标记物及治疗靶点的应用的制作方法

本发明涉及一种生物标记物和治疗靶点，特别涉及TFEB作为脑卒中生物标记物及治疗靶点的应用。

背景技术：

脑卒中是由各种病因使供应脑部血液的血管发生病变所致的一种神经系统疾病。在世界范围内，脑卒中是成年人永久性致残及死亡的主要原因。现已成为世界上三大致死性疾病之一。临床上治疗主要是溶栓、挽救缺血区域(半暗带)的濒临死亡的神经元和促进损伤后神经功能的恢复。防治缺血性脑血管疾病是目前人类迫切需要解决的医学难题。目前美国FDA仅批准了组织纤溶酶原活化因子(tPA)用于中风后的溶栓治疗，但其治疗时间窗很窄，只有在中风4.5小时内使用才有效；而且还存在出血以及缺血再灌加重脑损伤的危险性。近几年，一些神经保护剂用于临床前研究中，但它们中有的治疗作用不确切或特异性不强，有的毒副作用较大、耐受性小，因而大多数被终止于临床实验。有的药物还处于临床前或临床研究阶段，很难在防治缺血性脑卒中发挥积极影响。因而，研发出快速有效、安全稳定及治疗靶点明确的防治脑缺血药物迫在眉睫。

目前，TFEB在脑卒中的作用尚不明确，因此，阐明TFEB在脑卒中的变化规律以及寻找一个通过选择性调控TFEB的药物对于脑卒中的治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

技术问题

为了解决现有技术中存在的问题，本发明发现，转录因子 -EB(Transcription factor-EB，TFEB)的表达量与脑卒中病情的进展存在相关性，并发现TFEB能够通过调控自噬-溶酶体通路，改变脑卒中的疾病进程。因此，本发明的目的在于提供一种新的脑卒中的生物标记物及治疗靶点。

解决方案

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测转录因子 -EB(Transcription factor-EB，TFEB)表达量的试剂在制备诊断脑卒中的试剂或试剂盒中的用途。

所述检测的对象为神经元细胞。

本发明还提供了一种靶向转录因子-EB(Transcription factor-EB，TFEB) 的物质在制备治疗脑卒中的药物中的用途。

所述药物靶向于神经元细胞中的TFEB。

所述药物使TFEB在神经元细胞中过表达。

过表达的TFEB通过调控脑缺血后自噬-溶酶体通路的激活而发挥脑缺血保护作用。

所述过表达的TFEB能够提高溶酶体的功能，加速自噬小体的降解。

所述脑卒中的治疗包括降低脑梗死体积、降低脑含水量或降低神经功能评分中的至少一种。

本发明还提供了一种转录因子-EB(Transcription factor-EB，TFEB)在制备治疗脑卒中的药物中的用途。

所述药物使TFEB在神经元细胞中过表达。

所述过表达的TFEB通过调控脑缺血后自噬-溶酶体通路的激活而发挥脑缺血保护作用。

所述过表达的TFEB能够提高溶酶体的功能，加速自噬小体的降解。

所述脑卒中的治疗包括降低脑梗死体积、降低脑含水量或降低神经功能评分中的至少一种。

本发明还提供了一种治疗脑卒中的药物组合物，其包含上述的药物、和临床上常用的抗脑中风的药物。

所述临床上常用的抗脑中风的药物包括3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮、重组组织型纤维蛋白酶原激活剂(r-tPA)。

所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、口服液或注射液。

本发明还提供了一种上述的药物组合物在制备治疗脑卒中的药物中的用途。

所述脑卒中的治疗包括降低脑梗死体积、降低脑含水量或降低神经功能评分中的至少一种。

有益效果

本发明的研究表明，TFEB可以作为脑卒中诊断的生物标记物，并且可以作为脑缺血治疗的靶点，因此，检测TFEB表达量的产品和靶向TFEB的药物，对脑卒中的诊断和治疗具有积极的作用。

附图说明

包含在说明书中并且构成说明书的一部分的附图与说明书一起示出了本发明的示例性实施例、特征和方面，并且用于解释本发明的原理。

图1A是pMCAO后不同时间点TFEB在细胞核中的表达情况。

图1B是图1A的半定量统计图。

图1C是考察pMCAO后不同时间点TFEB在神经元细胞核中的定位情况。

图1D是考察pMCAO后不同时间点TFEB在小胶质细胞中的定位情况。

图1E是考察pMCAO后不同时间点TFEB在星形胶质细胞中的定位情况。

图2是原代神经元OGD后不同时间点TFEB在细胞核中的定位情况。

图3A是运用westernblot技术验证TFEB过表达病毒的表达效果。

图3B是图3A的半定量统计图。

图3C是运用免疫荧光技术验证TFEB过表达病毒的表达效果。

图3D是过表达TFEB对自噬-溶酶体通路的影响。

图3E是图3D的半定量统计图。

图3F是运用免疫荧光技术验证过表达TFEB后不同组别动物皮层神经元的存活情况。

图3G是过表达TFEB对pMCAO后缺血损伤的影响。

图3H是图3G的半定量统计图

图3I是过表达TFEB对pMCAO后大鼠神经功能评分的统计图

图3J是过表达TFEB对pMCAO后大鼠脑含水量的统计图。

图4A是运用westernblot技术验证TFEB过表达病毒的表达效果。

图4B是图4A的半定量统计图。

图4C是运用免疫荧光技术验证敲低TFEB病毒的表达效果。

图4D是运用免疫荧光技术验证敲低TFEB对ALP相关蛋白表达的影响。

图4E是运用westernblot技术验证敲低TFEB对ALP相关蛋白表达的影响。

图4F是图4E的半定量统计图。

图4G是运用免疫荧光技术验证敲低TFEB对神经元存活的影响。

图4H是敲低TFEB后对pMCAO后缺血损伤的影响。

图4I是图4H的半定量统计图

图4J是敲低TFEB对pMCAO后大鼠神经功能评分的统计图

图4K是敲低TFEB对pMCAO后大鼠脑含水量的统计图

图5是实施例2的实验流程图

图6A是使用皮层神经元特异性启动子CaMKIIa启动EGFP，与靶向 TFEB敲低的shRNA组成融合蛋白的质粒图谱

图6B是特异性TFEB敲低的shRNA使用基于miR30结构的序列元件，基于miR30结构的shRNA干扰框架

图7是特异性过表达神经元中的TFEB，同时使病毒载体具有足够的容量表达TFEB基因的CDS序列

具体实施方式

实施例1：大鼠永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)后不同时间点TFEB 在细胞核中的表达情况以及原代神经元氧糖剥夺(OGD)后不同时间点TFEB 在细胞核中的定位情况

1.材料：

实验动物

SD大鼠，雄性，体重260-280g，由沈阳药科大学动物中心提供，动物合格证号：211002300015664

细胞

大鼠原代皮层神经元：新生大鼠(出生24小时以内)的皮层神经元

2.方法：

2-1.大鼠永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)模型的建立

根据Longa法制备pMCAO模型

(1)pMCAO手术前大鼠禁食不禁水12小时，然后用3.5％的水合氯醛 (0.1mL/kg)腹腔麻醉，仰卧固定，颈部中线处剪开一个约0.5cm的切口，用止血钳钝性分离肌肉层，暴露右侧颈总动脉(CCA，common carotid artery)、颈外动脉(ECA，external carotid artery)和颈内动脉(ICA，internal carotid artery)；

(2)分离并结扎ECA，用动脉夹夹闭ICA，于CCA备线并于近心端剪一小口，由此口插入线栓，打开动脉夹，当感觉到有阻力时停止插入线栓，固定线栓，线栓插入的深度以ICA与ECA分叉处开始计算约18mm；

(3)术毕，剪去多余的线栓，缝合皮肤，用碘伏进行消毒防止术后感染；

2-2.假手术组的建立

除了未插入线栓之外，其余手术过程同上。

2-3.原代皮层神经元的分离及培养

(1)新生大鼠(出生24小时以内)经75％酒精消毒，于冰上断头分离出大脑部分；

(2)将分离出来的全脑放入盛有DMEM/F12培养液的平皿中，平皿置于冰上，分离出皮层，用显微镊将皮层表面覆盖的血管膜去除，弃去其他脑区的组织；

(3)用眼科剪将分离出的皮层剪成1mm³的小块，每只新生鼠加入1mL 的0.25％胰蛋白酶，用胶头滴管将胰蛋白酶和组织块一并转移到离心管中，37℃水浴消化15分钟，用少量含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，弃去上清液，加入含10％FBS的DMEM/F12培养液并用巴氏吸管吹打数次，制成细胞悬液；

(4)细胞悬液经200目筛网过滤，滤液用血球计数板计数，调整细胞密度为1×10⁶个/mL；

(5)将调好密度的细胞悬液种植于预先用多聚赖氨酸处理过夜的细胞培养皿或板中，在含5％的CO2，37℃培养箱中培养4小时，待细胞贴壁后全量换成含有2％B27血清的Neurobasal培养液，作用72小时后换新培养液，培养5天即可用于实验。

2-4.原代皮层神经元氧糖剥夺(OGD)模型的建立

在原代神经元培养的第5天，细胞用37℃的PBS漂洗2遍，然后更换 DMEM无糖培养液，将细胞置于缺氧小室中，缺氧小室充入含有5％的CO2和95％的N2的混合气体，流速为20L/分钟，充气4分钟。之后将缺氧小室置于 37℃的恒温培养箱中孵育相应的时间，空白组细胞用PBS漂洗后更换成 DMEM含糖培养液，于37℃恒温培养箱中孵育相等的时间。在对应时间点进行免疫印迹和免疫荧光的检测。

2-5.免疫组织荧光考察蛋白的共定位

(1)取材

上述2-1建立的pMCAO模型大鼠经3.5％的水合氯醛麻醉后，仰卧固定，迅速打开胸腔，分离心脏及主动脉，用钝性注射器从左心室插入至主动脉，用动脉夹固定，剪开右心耳，然后快速推入含有肝素的生理盐水(4000U/L) 200mL以冲出动物体内的血液(50mL/分钟),待右心耳流出液体基本不含血液时，推入4％的多聚甲醛(PFA)120mL，速度为5mL/分钟。之后改为滴注 4％的PFA180mL，速度为2滴/秒，持续大约40分钟。

(2)后固定

大鼠经4％的PFA灌流固定后，取脑，将脑放入4％的PFA中后固定24小时；

(3)脱水

脑组织经PFA后固定后，分别放入20％和30％的蔗糖中脱水24小时，待脑组织沉底后取出。

(4)冰冻切片

脑组织经30％的蔗糖脱水后，用滤纸吸干脑组织表面的液体。然后在脑组织周围均匀涂上包埋剂(SAKUPA 4583)，置于切片机速冻台上速冻(温度为-65℃)约10分钟，之后在工作台上平衡5分钟，在置于-30℃的工作温度下切片，厚度为20μm，室温风干后置于-80℃中保存。

(5)免疫荧光双染

1)脑组织切片从-80℃冰箱中取出，复温30分钟后，经0.01M的PBS漂洗3遍，每遍5分钟；

2)组织切片置于预先加热至95℃的柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)中微波抗原修复。每隔3分钟抗原修复一次，每次微波低火加热6分钟，共计20分钟，温度始终维持在85-95℃之间，然后冷却至室温。用PBS漂洗3遍，每遍5分钟；

3)用含0.3％的TritonX-100(V/V)的山羊血清封闭液室温封闭1小时，弃封闭液；

4)每张脑片滴加30-40μL的一抗(Anti-TFEB抗体、Anti-NeuN抗体、 Anti-Iba1抗体、Anti-GFAP抗体、Anti-Flag抗体、Anti-LAMP1抗体、 Anti-Cahtepsin D抗体，一抗稀释液，0.2％的TritonX-100，0.01M的PBS)，4℃过夜。16小时后，将脑组织切片从4℃拿出，室温复温30-60分钟。用PBST (0.01M PBS，1mL Tween-20)清洗3遍，每遍10分钟；

5)每张脑片滴加30-40μL的荧光素标记的二抗(Cy3标记山羊抗兔IgG、 Cy3标记驴抗山羊IgG、FITC标记的山羊抗小鼠IgG，二抗稀释液，0.01M的 PBS)，避光，室温孵育2小时。然后用PBST清洗3遍，每遍10分钟；

6)DAPI染色液(0.01M PBS配置)37℃孵育0.5小时，PBST清洗3遍，每遍5分钟；

7)每张脑片滴加5μL的抗荧光淬灭剂(碧云天P0128)封片，避光晾干；

8)共聚焦荧光显微镜下观察，如图1C-E所示。

2-6.免疫细胞荧光考察蛋白的共定位

(1)上述2-4建立的细胞从缺氧小室中取出，弃去培养液，用37℃的PBS 漂洗细胞2遍，每遍5分钟；

(2)用4％的PFA固定15分钟，之后用PBS漂洗2遍，每遍5分钟；

(3)细胞经0.1％的皂苷(Amresco 0163)进行透化，10分钟，之后用 PBS漂洗2遍，每遍5分钟；

(4)用3％的BSA封闭30分钟，弃封闭液，之后加入PBS配置的TFEB一抗(Anti-TFEB抗体，一抗稀释液，0.2％的TritonX-100，0.01M的PBS)稀释液孵育，4℃过夜；

(5)回收一抗，用PBST漂洗细胞3遍，每遍5分钟；

(6)加入对应的Cy3标记的二抗(Cy3标记山羊抗兔IgG、Cy3标记驴抗山羊IgG，二抗稀释液，0.01M的PBS)稀释液，室温孵育1小时，之后用PBS 漂洗5遍，每遍5分钟；

(7)加入含DAPI染色液的PBS溶液长期于4℃储存；

(8)共聚焦荧光显微镜下观察，如图2所示。

2-7.免疫印迹考察蛋白的表达

(1)细胞核蛋白的提取

实验动物在检测相应时间点进行断头取脑，用冷的生理盐水冲洗脑组织表面的血迹，在冰上分离皮层脑区，转移至1.5mL的离心管中；在蛋白抽提前取出抽提试剂Nc-Buffer A和Nc-Buffer C(细胞核蛋白提取试剂盒，康维世纪CW0199S)进行预冷；称组织重量，每100mg组织中加入1mL的Nc-Buffer A(按照1:99比例在蛋白抽提前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂)，用匀浆器在冰上充分匀浆，放置在冰上孵育20分钟；加入55μL的Nc-Buffer B(细胞核蛋白提取试剂盒，康维世纪CW0199S)，涡旋5秒以充分混匀，放置在冰上孵育 1分钟；4℃12000×g离心15分钟，收集上清(尽量收集干净上清液)至新的离心管中，-20℃保存(此提取液为细胞浆蛋白)；上步所得的沉淀中加入 500μL的Nc-Buffer C(使用前按照1:99比例加入蛋白酶抑制剂)，涡旋5秒以充分混匀，重悬沉淀，冰上孵育40分钟，每隔10分钟涡旋混匀一次，每次约 15-30秒；4℃12000rpm离心15分钟，收集上清(尽量收集干净上清液)至新的离心管中，-20℃保存(此为细胞核蛋白提取液)。

(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及染色

分别配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，灌制SDS-PAGE(6×8×0.1cm)。装好电泳槽后，加入电泳缓冲液，上样，组织总蛋白30μg/孔，marker 5μg/ 孔。恒压电泳，样品在浓缩胶中以60V电泳，待溴酚蓝迁移至分离胶界面后，样品在分离胶以120V电泳至溴酚蓝迁移至凝胶底部，关闭电源。取下凝胶，进行电转印。

(3)免疫印迹

1)PVDF膜在甲醇中活化15秒，之后将膜、湿转滤纸和海绵在转移缓冲液中充分浸泡15分钟；

2)将SDS聚丙稀胺凝胶取出后，将凝胶按叠成“三明治”状，插入转移池中，凝胶一面接阴极，4℃下260mA恒流转印相应时间；

3)转移后的PVDF膜在TBST中漂洗，加入5％的脱脂奶粉封闭，室温1 小时；

4)将一抗(Anti-TFEB抗体、Anti-Flag抗体、Anti-Lamin B抗体、 Anti-SQSTM1抗体、Anti-Ubiquitin抗体、Anti-LAMP1抗体、Anti-Cathepsin B 抗体、Anti-Cahtepsin D抗体、Anti-LAMP2抗体、Anti-LC3(B)抗体、Anti-β -actin抗体)用5％脱脂奶粉稀释至适当浓度，4℃孵育过夜；

5)用TBST漂洗膜4次，每次5分钟；

6)将二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG) 用5％脱脂奶粉稀释至适当浓度，室温孵育1小时；

7)用TBST漂洗膜3次，每次10分钟；

8)暗室中将ECL试剂(Perkinelmer NEL 105)加到膜蛋白面上，反应1 分钟后，置于曝光暗盒中，盖X-光胶片，曝光一定时间；

9)取出胶片放入显影液中，待出现条带后，以自来水漂洗，置于定影液中，最后用自来水冲洗，晾干，扫描图片保存，如图1A所示。

3.实验结果：

如图1A图所示，在pMCAO后的3小时至6小时，TFEB在细胞核中的表达逐渐增多，在6小时的时候达到了峰值。随着缺血时间的延长，TFEB在细胞核中的表达逐渐下降，在24小时的时候低于正常水平而在48小时达到了最低水平。图1B为条带半定量的结果。

如图1C所示，红色为通过TFEB抗体标记的TFEB蛋白，绿色为神经元标记物(Neuronal Nuclei，NeuN)，在假手术组中，TFEB以弥散的形式分布在细胞浆中，在pMCAO的3小时至6小时期间，TFEB被激活，表现为红色的点状聚集且荧光强度逐渐增加并逐渐向细胞核中转移，在pMCAO后6小时，在细胞核中的表达达到了峰值。随着缺血时间的延长，TFEB又逐渐出核，同时伴随着表达量的降低。共定位结果提示，TFEB蛋白与神经元的表达位置出现了大部分的重合，提示TFEB主要表达在神经元中。

如图1D所示，红色为TFEB蛋白，绿色为小胶质细胞标记物Iba1，共定位结果显示TFEB在小胶质细胞中的表达量较低。

如图1E所示，红色为TFEB蛋白，绿色为星形胶质细胞标记物GFAP，共定位结果提示TFEB在星形胶质细胞中的表达量较低。

如图2所示，通过免疫荧光方法考察了原代神经元经OGD造模后不同时间点TFEB在细胞核中的表达情况。红色为TFEB抗体标记的TFEB蛋白，蓝色为细胞核。在空白组中，TFEB以弥散的形式分布在细胞浆中，当受到 OGD的刺激后，TFEB被激活，表现为点状聚集且红色的荧光强度增加，随着OGD时间的延长，TFEB点状聚集的程度增加且逐渐向细胞核中转移，在 OGD后6小时达到了峰值，而随后在OGD后12小时，TFEB在细胞核中的表达又有所降低。以上结果表明，神经元OGD后3小时至6小时，TFEB逐渐被激活并向细胞核中转移，在OGD后12小时TFEB在细胞核中的表达又逐渐降低。

4.结论：

1)在pMCAO后3小时至48小时期间存在TFEB先入核而随后又出核的时间依赖性变化，在pMCAO后6小时在细胞核中的表达达到峰值。

2)在pMCAO后3小时至48小时期间，TFEB出现先入核随后又出核的时间依赖性变化且TFEB主要表达在神经元中。

3)TFEB在原代皮层神经元氧糖剥夺(OGD)后1小时至12小时期间出现了先入核随后出核的时间依赖性变化。

实施例2：特异性过表达或敲低TFEB对pMCAO后ALP功能及缺血损伤的影响

1.材料：

实验动物

SD大鼠，雄性，体重260-280g，由沈阳药科大学动物中心提供，动物合格证号：211002300015664

2.方法：

实验设计及分组

第一部分：pMCAO后3小时至48小时，TFEB的变化规律及细胞定位 SD雄性大鼠，体重260-280g，随机分为假手术组，模型组(3、6、12、 24、48小时)，每组10只动物。经pMCAO手术造模，5只动物在造模后的不同时间点分离皮层脑区的组织进行Western blot检测，5只同时进行免疫荧光检测，以考察TFEB在pMCAO后的变化规律和细胞定位。

第二部分：神经元特异性地敲低/过表达TFEB后，对pMCAO后缺血性损伤的影响

SD雄性大鼠，体重120-150g(4周龄)，随机分为假手术+GFP空白病毒组，假手术+TFEB敲低/过表达组，pMCAO+GFP空白病毒组， pMCAO+TFEB敲低/过表达组，每组20只动物，其中10只动物用于行为学检测，5只动物用免疫荧光实验，5只动物用于免疫印迹实验。在病毒注射的第 28天进行腺相关病毒敲低/过表达效率的验证。在病毒注射的第29天，进行 pMCAO造模手术，敲低TFEB组在pMCAO后的6小时进行检测，过表达TFEB 组在pMCAO后的24小时进行检测。分别考察敲低/过表达TFEB后对模型大鼠脑梗死体积、脑含水量、神经功能评分及神经元存活率的影响。

第三部分：神经元特异性地敲低/过表达TFEB后，对pMCAO后自噬-溶酶体通路变化的影响

在病毒注射的第29天，进行pMCAO造模手术，敲低TFEB组在pMCAO 后的6小时进行检测，过表达TFEB组在pMCAO后的24小时进行检测。分别考察敲低/过表达TFEB后对模型大鼠ALP通路相关蛋白表达的影响，包括自噬小体相关蛋白LC3、SQSTM1、Ubiquitin及溶酶体相关蛋白LAMP1、 LAMP2、Cat.B及Cat.D表达的影响。

实验流程如图5所示。其中

(1)神经元TFEB敲低的腺相关病毒(AAV)载体构建

为特异性敲低皮层神经元中TFEB的表达，本研究使用皮层神经元特异性启动子CaMKIIa启动EGFP，与靶向TFEB敲低的shRNA组成融合蛋白，质粒图谱如图6A图所示。为增加shRNA的敲低效率以及干扰潜能，特异性TFEB 敲低的shRNA使用基于miR30结构的序列元件，基于miR30结构的shRNA干扰框架如图6B图所示。这种方法将shRNA序列表达在生理情况即存在的 miR30表达框架可以显著增加shRNA序列被内源性Drosha酶识别以及处理的效率，miR30序列插入位置为FLAG与WPRE表达框之间。

(2)敲低TFEB的shRNA质粒设计及测序结果

TFEB的干扰序列由和元生物设计，其干扰序列为如表1所示：

表1TFEB的干扰序列

shRNA序列连入AAV干扰质粒后进行测序验证，如表2所示，序列1(SEQ ID NO:1)和序列2(SEQ ID NO:2)为敲低质粒的基因表达框(SEQ ID NO:6) 中靶向TFEB的shRNA发夹序列(TFEB的干扰序列)，序列3(SEQ ID NO:3) 和序列4(SEQ ID NO:4)为敲低质粒的基因表达框(SEQ ID NO:6)中miR30 的侧翼序列，序列5(SEQ ID NO:5)为敲低质粒的基因表达框(SEQ ID NO:6) 中miR30的Loop环结构。测序结果表明质粒构建过程中未出现突变以及移码现象，可以用于后续的病毒包装。

表2shRNA序列连入AAV干扰质粒后进行测序的结果

(3)神经元TFEB过表达腺相关病毒载体的构建

如图7所示，为特异性过表达神经元中的TFEB，同时使病毒载体具有足够的容量表达TFEB基因的CDS序列，本研究使用较CaMKIIa启动子片段更小且更强力的SYN以特异性地在神经元中过表达TFEB过表达。

(4)过表达TFEB质粒基因测序结果

在成功将TFEB的CDS序列连入病毒质粒后，进行CDS序列的全片段测序，测序结果如序列7(SEQ ID NO:7)所示，其中包含的Flag蛋白基因序列如序列8(SEQ ID NO:8)所示，TFEB目的基因序列如序列9(SEQ ID NO:9) 所示，测序结果表明质粒构建过程中未出现突变以及移码现象，可以用于后续的病毒包装。

(5)腺相关病毒的定位注射

SD雄性大鼠，体重为120-150g(4周龄)，用于病毒的定位注射，大鼠经3.5％的水合氯醛麻醉，俯卧固定于脑立体定位仪上。用75％的乙醇在头部进行消毒后备皮，两眼的中线处向后剪1cm的口，剪开筋膜，暴露颅骨，用干棉球止血并擦掉结缔组织，找到前囟位置，读取坐标。参照大鼠脑立体定位 Paxinos和Watson图谱和文献确定注射部位的坐标。皮层脑区的坐标为[AP:1.8 (site1),0.3(site2),1.2(site3)；ML:3.0；DV:2.5]，把注射器移到注射部位的上方，然后在颅骨相应的位置进行标记，钻开表面颅骨，用微量注射器抽取相应的病毒溶液(2μL/site)进针到位点，调节自动进样器，设置给药速度为 0.4μL/分钟，留针10分钟(缺血侧)，拔针(2分钟)后缝合皮肤。术后予青霉素防止感染。病毒表达周期为4周。

(6)大鼠pMCAO的模型的建立

同实施例1

(7)检测指标

1)TTC染色：对术后24h大鼠进行快速断头取脑，完整脑组织经-20℃冰冻20min，自极开始切取冠状脑片，切成6片，每隔2mm切一片。将脑片至于盛有1％TTC溶液的玻璃皿中，置于37℃避光孵育30min，于15min时轻柔翻动脑片，使其均匀接触到染色液。TTC染色后，将脑片置于4％多聚甲醛溶液中避光固定30min后取出拍照，照片使用Image Pro Plus图像分析软件进行脑梗塞面积的分析，正常脑组织区域为红色，梗塞及梗塞波及区域为白色，按照体积计算公式，计算脑梗塞体积比。

梗塞体积：V＝(A1+A2+……+An)t/2。

t为切片厚度，A1和A2分别表示切块嘴、尾侧梗塞面积，An表示切块嘴与尾侧之间中间脑片的梗塞面积。

脑梗塞体积比％＝梗塞体积/全脑体积×100。

2)脑含水量的测定：术后24h断头取脑时，记录脑组织的重量(脑湿重)， TTC染色后，将脑片放入垫有锡箔纸的玻璃皿中，于37℃烘干72h至恒重并记录重量(脑干重)，根据公式计算脑含水量：脑含水量％＝(脑湿重-脑干重) /脑湿重×100。

3)神经功能评分：选择改良神经损伤评分(Modified Neurological Severity Score，mNss)对术后24h动物进行神经功能检测。

4)免疫荧光考察蛋白的共定位

同实施例1

5)免疫印迹考察蛋白的表达

同实施例1

统计学分析

运用SPSS 19.0软件进行统计学分析，脑梗死、脑含水量及免疫荧光和免疫印迹实验结果采用单因素方差分析进行统计，并选择Tukey检验进行多重比较。神经行为学评分采用Kruskal-Wallis test进行均值比较，并选择Dunn’s 进行多重比较。数值以均值±标准误来表示。

P<0.05认为具有统计学显著性差异。

3.实验结果：

1)神经元特异性过表达TFEB对pMCAO后48小时ALP功能及缺血损伤的影响

首先我们验证TFEB过表达病毒的表达效果。如图3A所示，Western结果表明，过表达TFEB后能够显著的增加Flag-TFEB融合蛋白的表达及外源性 TFEB的表达。图3B为图3A的半定量结果。

如图3C所示，免疫荧光结果显示，绿色为Flag蛋白，红色为TFEB蛋白，在过表达TFEB后能够显著增加pMCAO后外源性TFEB的表达。

如图3D所示，神经元特异性过表达TFEB在pMCAO后48小时显著提高溶酶体功能，加速自噬小体降解。图3E为图3D的半定量结果。

如图3F所示，免疫荧光结果显示，绿色为TFEB蛋白，红色为NeuN，蓝色为DAPI，在过表达TFEB后能够显著增加pMCAO后神经元的存活情况。

如图3G所示，接下来过表达TFEB对pMCAO后缺血损伤的影响，我们发现过表达TFEB能够显著的降低pMCAO后48小时的脑梗死体积，脑含水量和神经功能评分。图3H为图3G的半定量结果。

2)神经元特异性敲低TFEB对pMCAO后ALP功能及缺血损伤的影响

首先我们验证TFEB敲低病毒的表达效果。如图4A至4C所示，Western blot以及免疫荧光结果所示，TFEB敲低的AAV在基础水平下具有较高的敲低效率且能在缺血的过程中显著下调入核的TFEB蛋白。

(1)敲低TFEB对pMCAO后溶酶体关蛋白LAMP1及Cat.D共定位的影响

如图4D所示，通过免疫荧光方法考察敲低TFEB后对溶酶体相关蛋白 LAMP1及Cat.D共定位的影响。绿色为外源性表达的绿色荧光蛋白GFP，蓝色为通过LAMP1抗体标记的LAMP1蛋白，红色为通过Cat.D抗体标记的Cat. D蛋白，在假手术中给予TFEB敲低的AAV后够明显降低LAMP1及Cat.D的表达及共定位面积。经pMCAO造模后，LAMP1及Cat.D的表达及共定位面积较假手术组相比有显著增加，具体表现为二者的荧光强度的增加及重合面积的增加。而在模型大鼠给予TFEB敲低的AAV后能够显著地逆转pMCAO介导的LAMP1及Cat.D表达的增加，以上结果表明，皮层神经元特异性地敲低 TFEB能够显著降低pMCAO所导致的溶酶体的激活。

(2)敲低TFEB后对pMCAO后ALP相关蛋白表达的影响

如图4E所示，在成功敲低神经元中的TFEB后，通过Western blot方法检测了敲低TFEB在pMCAO后6小时对ALP相关蛋白表达的影响。如图4E和图 4F所示，在pMCAO后6小时，溶酶体相关蛋白Cat.B及Cat.D的表达较假手术组相比有显著增加，敲低TFEB后，能够显著降低TFEB调控的靶基因LAMP1、 Cat.B及Cat.D的表达，而对非TFEB调控的靶基因LAMP2蛋白的表达则没有显著的影响。此外，敲低TFEB后能够显著增加pMCAO后6小时自噬小体 LC3-II和自噬底物Ubiquitin的表达。以上结果表明，敲低TFEB能够显著抑制 ALP的激活。

(3)敲低TFEB后对pMCAO后神经元数量的影响

如图4G所示，通过免疫荧光方法考察了敲低TFEB对pMCAO后神经元的存活的影响。绿色为外源性表达的绿色荧光蛋白GFP，红色为神经元标记物 NeuN，蓝色为细胞核标记物DAPI，在假手术组中敲低TFEB对神经元的数量并无显著的影响。在pMCAO后造模后，神经元的数量有显著的降低，当给予TFEB敲低的AAV后能够进一步降低NeuN阳性的细胞数量。

(4)敲低TFEB对pMCAO后缺血损伤的影响

如图4H和图4I所示，在敲低TFEB后4周进行pMCAO造模，在造模后的6 小时检测。给予GFP标记的对照AAV对pMCAO所致的脑梗死、脑含水量及神经功能评分并无明显的影响，而在给予TFEB敲低AAV后能够显著地增加 pMCAO后6小时的脑梗死体积和神经功能评分以及pMCAO后6小时的脑含水量。

4.结论

1)神经元特异性过表达TFEB在pMCAO后48小时显著提高溶酶体功能，加速自噬小体降解。

2)过表达TFEB能够显著的降低pMCAO后48小时的脑梗死体积，脑含水量和神经功能评分。

3)皮层特异性地敲低TFEB能够加重pMCAO后6小时的缺血性损伤。

4)敲低TFEB后能够加重pMCAO后的神经元损伤。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对TFEB作为脑卒中检测的生物标记物以及作为治疗脑卒中治疗药物靶点的可能性作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 沈阳药科大学

<120> TFEB作为脑卒中生物标记物及治疗靶点的应用

<130> 2017

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(DNA)

<400> 1

ctgctacaca tcagctccaa tc 22

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gattggagct gatgtgtagc at 22

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tcgagaaggt atattgctgt tgacagtgag cg 32

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tgcctactgc ctcgg 15

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<211> 1839

<212> DNA

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aaaatttgtg aaagattgac tggtatctaa ctatgtgtc 1839

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