本发明涉及具有抗肿瘤活性的化合物
技术领域：
，具体涉及吲哚里西丁类化合物及其制备方法和在制备激酶抑制剂和抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，其在中国乃至全世界范围内的死亡人数中列第二位，仅次于心脑血管疾病。因此，寻找到新型、高效、低毒的抗肿瘤药物是当今世界的一大难题。从天然资源中寻找新的抗肿瘤药物成为研究的趋势，其中微生物由于特殊的生存环境，有可能产生结构新颖、作用机制独特的活性次级代谢产物。因此，从微生物中寻找活性成分来预防和治疗肿瘤，越来越引起人们的重视。放线菌作为一类重要的微生物，以产生种类繁多的生物活性物质而广泛受到重视。目前，放线菌仍是抗生素的主要微生物来源，临床使用的抗生素有70％是由放线菌产生的。现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4000多种，其中，有50多种抗生素已经得到广泛的应用，如链霉素、红霉素、多氧霉素、金霉素、卡那霉素、氯霉素和庆大霉素等用于临床治疗人的多种疾病。随着病原微生物对抗生素抗性的提高，寻找具有新型作用机制的抗生素显得十分必要。技术实现要素：本发明提供了吲哚里西丁类化合物及其制备方法和在制备激酶抑制剂和抗肿瘤药物中的应用，该化合物具有ROCK2蛋白激酶抑制活性，结构新颖，该类化合物利用高氏一号液体培养基震荡培养方法，从发酵产物中分离制备得到。吲哚里西丁类化合物，为式I、式II、式Ⅲ和式Ⅳ结构的化合物；R1＝H,OH或Cl；R2＝H或OH。进一步优选，所述的式I结构的化合物，为以下化合物：所述的式II结构的化合物，为以下化合物：所述的式Ⅲ结构的化合物，为以下化合物：所述的式Ⅳ结构的化合物，为以下化合物：该类化合物具有较好的ROCK2蛋白激酶抑制活性，ROCK2是指相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2。具有蛋白激酶抑制活性的化合物的制备方法，由放线菌发酵产生，再通过分离纯化得到，易于操作和实施。所述的吲哚里西丁类化合物的制备方法，包括以下步骤：1)取放线菌接种到平板培养基上，静置活化培养，得到活化的放线菌的单菌落；2)将步骤1)中活化的放线菌的单菌落接种于液体培养基，在摇床中振荡培养，获得液体发酵产物；3)将液体发酵产物分离纯化得到式I、式II、式III和式Ⅳ结构的化合物，即具有ROCK2蛋白激酶抑制活性的化合物。步骤1)中，所述的放线菌，可采用现有技术，具体可采用市售产品，如采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomycessp.CICC41038，订购网址：http://www.china-cicc.org/。所述的静置活化培养的条件为：于26℃～30℃静置活化培养3天～7天，进一步优选，于28℃静置活化培养5天。步骤2)中，所述的液体培养基为高氏一号液体培养基。所述的高氏一号液体培养基：以发酵培养基1L计，可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，加水至1L，调pH7.2-7.4。所述的摇床中振荡培养的条件为：在摇床中以26℃～30℃、150rpm～210rpm振荡培养6～10天。进一步优选，在摇床中以28℃、180rpm振荡培养8天。步骤3)中，所述的分离纯化包括：将液体发酵产物用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后，进行硅胶柱层析，凝胶柱色谱分离，再通过反相高效液相色谱纯化，得到式I、式II、式III和式Ⅳ结构的化合物。所述的硅胶柱层析的条件：采用流动相体积比为50:1至0:1的二氯甲烷-甲醇溶液，即所述的二氯甲烷和甲醇的体积比为50:1至0:1。所述的凝胶柱色谱分离的条件：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)，采用的流动相为纯甲醇。所述的反相高效液相色谱纯化的条件：采用的填料为十八烷基键合硅胶，采用的流动相为乙腈-水体系。所述的式I、式II、式III和式Ⅳ结构的化合物，即具有ROCK2蛋白激酶抑制活性的化合物，表现出较好的激酶抑制作用，可应用于制备激酶抑制剂类药物。本发明提供的化合物可用于治疗与激酶抑制有关的急、慢性白血病、淋巴癌、乳腺癌、肺癌、肉瘤等癌症，艾滋病，老年痴呆症等疾病的药物。本发明采用人前列腺癌细胞株PC3进行活性评价试验，该类化合物通过蛋白激酶发挥细胞毒性作用，因此可用于制备蛋白激酶抑制剂，可用于制备抗肿瘤药物，特别适合用于制备抗前列腺癌药物。与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明具有ROCK2蛋白激酶抑制活性的化合物，可用于开发治疗与蛋白激酶抑制剂相关的疾病的药物。所述的式I、式II、式III和式Ⅳ结构的化合物，即具有ROCK2蛋白激酶抑制活性的化合物，表现出较好的激酶抑制作用，可应用于制备激酶抑制剂类药物。本发明提供的化合物可用于治疗与激酶抑制有关的急、慢性白血病、淋巴癌、乳腺癌、肺癌、肉瘤等癌症，艾滋病，老年痴呆症等疾病的药物。具体实施方式实施例1一、化合物的发酵放线菌采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomycessp.CICC41038；1)从原保存斜面或甘油管放线菌适量，接种到平板培养基上，于28℃培养箱中静置，活化培养5天，得到活化的放线菌的单菌落；2)将步骤1)中活化的放线菌的单菌落接种于含有250mL液体培养基的500mL锥形瓶中，每瓶含250mL高氏一号液体培养基(高氏一号液体培养基：以发酵培养基1L计，可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，加水至1L，调pH7.2-7.4)。在摇床中28℃下以180rpm振荡培养8天，获得到含有本发明具有蛋白激酶抑制活性的化合物的发酵液。二、化合物的制备将含有本发明具有蛋白激酶抑制活性的化合物的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得萃取液浓缩。将所得乙酸乙酯部位进行硅胶柱层析，用体积比为50:1至0:1的二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱，薄层检识含有新化合物的馏分，合并。所得馏分用SephadexLH-20凝胶柱色谱分离，洗脱剂为纯甲醇，合并含有新化合物的馏分。所得含有新化合物的馏分用反相高效液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长254nm)，采用的流动相为体积比为10％-50％(即乙腈与水的体积比为10：90至50：50)乙腈-水体系以10mL/min梯度洗脱40min，收集17-19min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物CyclizidineB，依据核磁共振数据如表1所示，其结构如下所示，为式I结构，R1和R2为H，分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS计算为C17H27NO2([M+H]+278.2118)，鉴定化合物为CyclizidineB(式I结构，R1和R2为H)，具体结构如下：表1(1HNMR600MHz，13CNMR150MHz，溶剂methanol-d4)所得含有新化合物的馏分用反相高效液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长254nm)，采用的流动相为体积比为10-100％(即乙腈与水的体积比为10：90至100：0)乙腈-水体系以10mL/min梯度洗脱40分钟，收集27-30min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物CyclizidineC。依据核磁共振数据如表2所示，其结构如下所示，为式I结构，R1为OH；R2为OH，分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS计算为C17H27NO4([M+Na]+m/z332.1838)，鉴定化合物为CyclizidineC(式I结构，R1为OH；R2为OH)，具体结构如下：表2(1HNMR600MHz，13CNMR150MHz，溶剂DMSO-d6)所得含有新化合物的馏分用反相高效液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长254nm)，采用的流动相为体积比为10％-60％(即乙腈与水的体积比为10：90至60：40)乙腈-水体系以10mL/min梯度洗脱40分钟，收集36-38min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物CyclizidineD。依据核磁共振数据如表3所示，其结构如下所示，为式I结构，R1为Cl；R2为OH，分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS计算为C17H26ClNO3([M+H]+m/z328.1648)，鉴定化合物为CyclizidineD(式I结构，R1为Cl；R2为OH)，具体结构如下：表3(1HNMR600MHz，13CNMR150MHz，溶剂Methaol-d4)所得馏分用反相高效液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长254nm)，采用的流动相为体积比为25％乙腈-水体系(即乙腈和水的体积比为25：75)以10mL/min等度洗脱，收集12-15min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物CyclizidineE，依据核磁共振数据如表4所示，其结构如下所示，为式II结构，R2为H，分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS为C17H22N+O2([M]+m/z272.1664)，鉴定化合物为CyclizidineE(式II结构，R2为H)，具体结构如下：表4(1HNMR600MHz，13CNMR150MHz，溶剂Methaol-d4)位置δC,typeδH(JinHz)180.0,qC284.1,CH4.35,d(7.6)371.4,CH5.51,overlap5140.9,CH8.54,d(6.5)6128.4,CH8.0,t(6.5)7147.9,CH8.63,t(6.5)8124.6,CH8.15,d(6.5)8a163.0,qC920.8,CH31.60,s10120.8,CH5.51,overlap11146.9,qC12131.2,CH6.37,d(15.6)13139.8,CH5.58,dd(15.6,8.8)1415.3,CH1.53,m157.9,CH20.82,m167.9,CH20.50,m1713.4,CH32.04,s所得馏分用反相高效液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长254nm)，采用的流动相为体积比为10％-100％乙腈-水体系(即乙腈与水的体积比为10：90至100：0)以10mL/min梯度洗脱40分钟，收集25-27min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物CyclizidineF，依据表5所示的核磁共振数据，其结构如下所示，为式II结构,R2为OH，分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS为C17H22N+O3([M]+288.1642)，鉴定化合物为CyclizidineF(式II结构,R2为OH)，具体结构如下：表5(1HNMR600MHz，13CNMR150MHz，溶剂Methaol-d4)位置δC,typeδH(JinHz)180.8,qC283.9,CH4.25,d(7.6)371.6,CH5.40,brt5132.9,CH7.79,d(6.4)6128.8,CH7.73,t(6.4)7130.0,CH7.91,t(6.4)8157.5,qC8a148.6,qC918.5,CH31.68,s10121.4,CH5.51,dd(9.0,6.4)11146.1qC12131.3,CH6.35,d(15.6)13139.6,CH5.54,dd(15.6,9.2)1415.3,CH1.53,m157.9,CH20.83,m167.9,CH20.48,m1713.4,CH32.0,s所得馏分用反相高效液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长254nm)，采用的流动相为体积比为10％-50％乙腈-水体系(即乙腈与水的体积比为10：90至50：50)以10mL/min梯度洗脱40分钟，收集16-19min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物CyclizidineG，依据表6核磁共振数据，其结构如下所示，为式III结构，R1为H；R2为H，分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS为C17H29NO([M+H]+296.2240)，鉴定化合物为CyclizidineG(式III结构，R1为H；R2为H)，具体结构如下：表6(1HNMR600MHz，13CNMR150MHz，溶剂Methaol-d4)位置δC,typeδH(JinHz)178.4,qC280.8,CH3.65,d(2.5)374.1,CH3.20,m553.2,CH23.67,overlap；2.99,m623.8,CH21.91,overlap；1.80,overlap722.7,CH21.98,overlap；1.57,overlap822.5,CH21.93,overlap；1.76,overlap8a72.7,CH3.07,dd(10.0,1.9)917.9,CH31.26,s1041.3,CH22.71,dd(13.5,4.8)；2.44,dd(13.5,10.6)11131.4,qC12130.2,CH6.04,d(10.6)13129.1,CH6.37,dd(15.0,10.6)14131.9,CH5.70,m1537.1,CH22.34,m1662.6,CH23.58,t(6.6)1716.3,CH31.84,s所得馏分用反相高效液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长254nm)，采用的流动相为体积比为10％-60％乙腈-水体系(即乙腈与水的体积比为10：90至60：40)以10mL/min梯度洗脱40分钟，收集21-24min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物A39-16K，依据表7的核磁共振数据，其结构如下所示，为式III结构，R1为Cl；R2为OH，分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS为C17H28ClNO4([M+H]+346.1781)，鉴定化合物为CyclizidineH(式III结构，R1为Cl；R2为OH)，具体结构如下：表7(1HNMR600MHz，13CNMR150MHz，溶剂Methaol-d4)所得馏分用反相高效液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长254nm)，采用的流动相为体积比为10％-60％乙腈-水体系(即乙腈与水的体积比为10：90至60：40)以10mL/min梯度洗脱40分钟，收集32-35min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物CyclizidineI，依据表8核磁共振数据，其结构如下所示，为式Ⅳ结构，R1为Cl；R2为OH，分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS为C17H28ClNO4([M+Na]+368.1601)，鉴定化合物为CyclizidineI(式Ⅳ结构，R1为Cl；R2为OH)，具体结构如下：表8(1HNMR600MHz，13CNMR150MHz，溶剂Methaol-d4)三、激酶抑制实验采用KinEASETM-TKassaykit(Cisbio),以星孢菌素(STU)为阳性药测定所得不同浓度化合物对ROCK2蛋白激酶的抑制活性。HRFT值通过测定蛋白激酶在经340nm紫外光激发后665nm和620nm的荧光比值获得，即HTRF值T＝[F665nm/F620nm]×104。蛋白激酶抑制％＝((T待测)-(Tmin))/((Tmax)-(Tmin))×100，Tmax为反应液的HTRF值，Tmin为没有蛋白激酶的空白反应液HTRF值。最终根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度IC50如表9所示：表9IC50(μM)化合物ROCKIICyclizidineC6.95CyclizidineF27.18CyclizidineG28.16CyclizidineH41.53CyclizidineI39.4根据表9结果所示，式I、式II、式III和式Ⅳ结构的化合物，表现出较好的激酶抑制作用，可应用于制备激酶抑制剂类药物。三、抗肿瘤活性实验人前列腺癌细胞PC3抑制率实验。取正常培养的处于对数期的细胞，3×104个/mL铺96孔板，加入药物培养24h后CCK8检测细胞活力。细胞存活率(％)＝实验组OD值/不加药组OD值×100％。最终根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度IC50如表10所示:表10IC50(μM)化合物PC3CyclizidineC0.52CyclizidineD33.31CyclizidineH17.07根据表10结果所示，本发明式I、式III结构的化合物，采用人前列腺癌细胞株PC3进行活性评价试验，该类化合物通过蛋白激酶发挥细胞毒性作用，因此可用于制备蛋白激酶抑制剂，可用于制备抗肿瘤药物，特别适合用于制备抗前列腺癌药物。当前第1页1 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