鸡Ⅰ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组、试剂盒以及其检测方法与流程

本发明涉及一种鸡星状病毒环介导等温扩增检测引物组、试剂盒以及其检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

星状病毒科（astroviridae）分为哺乳动物星状病毒属（mamastrovirus）和禽星状病毒属(avastrovirus)，其中禽星状病毒属分为3个种，分别为禽星状病毒gi.a型、禽星状病毒gi.b型和禽星状病毒gii.a型。根据不同来源和基因型，在家禽中鉴定出来6种不同的星状病毒，包括两种鸡源星状病毒（禽肾炎病毒（anv）和鸡星状病毒（castv））、两种火鸡源星状病毒（tastv-1和tastv-2）和两种鸭源星状病毒（dastv-1和dastv-2）。星状病毒是单股正链、无囊膜的小rna病毒，其基因组长度为6.5-7.5kb，有3个开放阅读框（orf），包括阅读框编码的无囊膜蛋白（orf1a）、病毒rna依赖的rna聚合酶（orf1b）和衣壳蛋白（orf2）。其复制方式与其他肠道病毒在合成次基因组时是截然不同的，在orf1与orf2之间存在一个含有丝氨酸蛋白酶的反转录移框信号序列，orf1a和orf1b之间有一个移动框结构，orf1编码一种蛋白酶和rna依赖的rna聚合酶，orf2表达亚基因组rna，编码病毒的衣壳蛋白，不同血清型之间的结构长短不一。

鸡星状病毒（castv）是一种极易在1-5周龄幼禽中流行的肠道病毒，常与其他肠道病毒发生混合感染。对鸡群肠道病毒感染情况进行持续监测，发现检测到的首个阳性样本往往就是星状病毒或星状病毒与其他病毒的混合感染。检测该病毒的感染情况对于疾病控制和临床诊断均具有重要意义。因此，一套简便快速、特异性强的星状病毒检测方法，可以为鸡腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持。

环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，lamp）方法可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列，lamp具有许多独特的优点：①lamp技术可以在等温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了pcr技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高。②lamp技术扩增的特异性非常高，使用的特异性引物可以识别目的序列上特异性的区域，对目的序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响。③阳性扩增反应中会产生大量的焦磷酸镁白色沉淀，扩增产物的检测方法多样，可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加入染料，根据颜色的变化通过荧光照射装置进行紫外光照射检测；还可以利用浊度仪，根据扩增产物混浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析。此外，lamp方法还具有特异性强，灵敏度较pcr方法高，无需pcr仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度（60℃～66℃），大大降低了检测的费用，特别适合基层现场使用。目前，还未见针对鸡ⅰ型星状病毒lamp方法的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种鸡ⅰ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒与lamp检测方法，应用该引物组可为基层现场检测提供一种简便、快捷的检测鸡ⅰ型星状病毒的方法。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：

所述检测鸡ⅰ型星状病毒的环介导等温扩增方法技术的核心在于引物的设计，设计出特异性强的引物是lamp的关键。引物组是由一对外引物、一对内引物组成，其中所述的外引物由f3和b3、内引物由fip和bip组成。根据genbank中登录的所有鸡ⅰ型星状病毒基因组序列特征，利用分子生物学软件进行分析比较，选择鸡ⅰ型星状病毒基因组保守区域片段，设计引物，包括外引物1对（castvⅰ-f3和castvⅰ-b3）和内引物1对（castvⅰ-fip和castvⅰ-bip），具体序列见seqid

设计的引物序列为：

castvⅰ-f3：5’-gcgacgtaggaccttaggt-3’；

castvⅰ-b3：5’-cccctacataacggttgctc-3’；

castvⅰ-fip：

5’-acagtgtcaggctcgtaggtcaataggtgatgacaggctcct-3’；

castvⅰ-bip：

5’-tctttgggatgtgggtgaagcccatcccacagaacgagagac-3’

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种含所述引物组的检测试剂盒，所述试剂盒还包括：sybrgreenⅰ荧光染料、2×反应缓冲液、所述的引物组、bstdna聚合酶、超纯水。

所述的检测试剂采用sybrgreenⅰ荧光染料，荧光试剂在反应前加入。

所述的2×反应缓冲液，包括ph8.8tris-hcl为40mm、kcl为20mm、mgso4为16mm、(nh4）2so4为20mm、tween20为0.2wt.%、betaine为1.6m、dntpsmixture每种均为2.8mm。

本发明的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：鸡ⅰ型星状病毒的lamp检测方法：lamp检测方法对应的lamp反应体系为25μl：2×反应缓冲液12.5μl,引物castvⅰ-f3(25pmol)1.0μl,引物castvⅰ-b3(25pmol)1.0μl，引物castvⅰ-fip(50pmol)0.5μl,引物castvⅰ-bip(50pmol)0.5μl,bstdna聚合酶1μl，待检样品cdna模板1.0μl，甜菜碱终浓度为4mol/l，荧光目视检测试剂sybrgreenⅰ荧光染料1.0μl，其余用超纯水补足至25.0μl，然后于64℃反应40min。

说明：反应前在pcr管内盖上加入1μlsybrgreenⅰ荧光染料，lamp反应结束后瞬时离心，于紫外灯下观察。若反应管中有目的dna的大量扩增，则反应管颜色呈现强烈绿色荧光，反之无荧光。

本发明还提供了所述的环介导等温扩增反应的引物组在制备鸡ⅰ型星状病毒快速诊断试剂中的用途。

本发明的优点在于：

1.灵敏度高，特异性强：lamp方法具有高特异性和高扩增效率。由于lamp方法使用4种识别模板dna上6个不同区域的引物,其特异性极高。

2.操作简单，成本较低：lamp反应的几个方面与其他扩增方法不同。lamp方法的主要特征是只需要一种酶,使其在64℃范围内的等温条件下扩增核酸。因此,它允许使用简单且具有低成本效益的反应设备,在临床检测中可以更好的实施。

3.效率高，时间短：lamp方法的分离效率非常高,等温也不需要变温过程的时间浪费。lamp方法在30～60min内对25μl反应混合物合成10～20μl特异性dna。

4.特异性强、灵敏度高：本发明建立的lamp方法检测出鸡ⅰ型星状病毒，所检测的阴性对照样品（如鸡新城疫病毒、家禽腺病毒、禽白血病病毒、鸡马立克氏病毒和鸡传染性支气管炎病毒）和水对照样品均无阳性结果出来，和pcr检测结果一致。但是lamp方法较常规pcr灵敏度高100倍左右，最低检测限为135copy/μl。

附图说明

图1为鸡ⅰ型星状病毒lamp特异性实验（直接观察），其中1：鸡ⅰ型星状病毒；对照家禽病毒4种，分别为：2：鸡新城疫病毒；3：禽腺病毒；4：禽白血病病毒；5：鸡马立克氏病毒；6：鸡传染性支气管炎病毒

图2为鸡ⅰ型星状病毒lamp方法敏感性试验（琼脂糖电泳）。其中m：dna分子量标准2000；1：1.35×10⁴copy/μl；2：1.35×10³copy/μl；3：1.35×10²copy/μl；4：1.35×10¹copy/μl；5：1.35×10⁰copy/μl；6：阴性对照。

具体实施方式

下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。

实施例1

一、实验方法

1.试验中所涉及的相关毒株和参考株

试验用鸡ⅰ型星状病毒、鸡新城疫病毒、家禽腺病毒、禽白血病病毒、鸡马立克氏病毒和鸡传染性支气管炎病毒均由扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室鉴定和保存。

1.核酸提取以及cdna模板的制备

用axyprepdna/rna提取试剂盒按照说明书方法进行操作提取鸡ⅰ型星状病毒的rna。并按照试剂盒的方法同时提取试验对照毒株的核酸（鸡新城疫病毒、禽白血病病毒和鸡传染性支气管炎病毒提取rna；家禽腺病毒、鸡马立克氏病毒提取核酸dna，提取的dna可直接用于lamp检测，提取的rna需反转录为cdna才可用于lamp检测

cdna模板制备的反转录体系如下：rna5μl，随机引物（0.1μg/μl）1μl，放入pcr仪70℃10min冰浴2min,后加入5×buffer4μl，10×dntp3μl,rna酶抑制剂0.5μl，反转录酶0.5μl，灭菌去离子水6μl补足20μl体系。反应程序为：42℃1h，70℃10min,4℃循环。

3.lamp检测方法的建立

3.1lamp的引物设计

根据genbank中登录的鸡ⅰ型星状病毒聚合酶1b蛋白编码的基因序列,以及本实验室自行扩增测序获得的序列特点，利用分子生物学软件进行分析比较，利用lamp引物设计的在线网站(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)设计引物，包括外引物1对（f3和b3）、内引物1对（fip和bip），具体序列见seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4。将设计好的相关引物，经ncbi数据库进行primer-blast分析，primer-blast分析表明，本发明设计的相关引物特异性强、无交叉干扰，符合试验设计预期。

设计的引物序列为：

castvⅰ-f3：5’-gcgacgtaggaccttaggt-3’；

castvⅰ-b3：5’-cccctacataacggttgctc-3’；

castvⅰ-fip：

5’-acagtgtcaggctcgtaggtcaataggtgatgacaggctcct-3’；

castvⅰ-bip：

5’-tctttgggatgtgggtgaagcccatcccacagaacgagagac-3’

3.2lamp方法的建立及优化

按照环介导等温扩增法dna扩增试剂盒（slp204laoopampdna扩增反应试剂盒）配置lamp试验反应液，反应体系为25μl。每25μl反应体系中含有：

2×反应缓冲液12.5μl,引物castvⅰ-f3(25pmol)1.0μl,引物castvⅰ-b3(25pmol)1.0μl，引物castvⅰ-fip(50pmol)0.5μl,引物castvⅰ-bip(50pmol)0.5μl,bstdna聚合酶1μl，待检样品cdna模板1.0μl，甜菜碱终浓度为4mol/l，荧光目视检测试剂sybrgreenⅰ荧光染料1.0μl，其余用超纯水补足至25.0μl。

反应优化条件：实验不同温度（60℃、62℃、64℃、66℃）、不同时间（10min、20min、30min、40min、50min、60min）检测引物组反应性能。优化后的反应条件为64℃反应40min，80℃10min终止反应。

3.3特异性试验

用优化后的lamp条件，检测相关实验样品模板核酸（鸡新城疫病毒、禽白血病病毒和鸡传染性支气管炎病毒使用反转录后的cdna；家禽腺病毒、鸡马立克氏病毒使用dna模板），评价建立的lamp方法的特异性。

3.4lamp检测方法的灵敏度试验

3.4.1阳性标准品的构建

根据实验室前期鉴定的鸡星状病毒（castvyz2017-2株）聚合酶1b蛋白编码的基因序列特点，利用引物设计软件primerpirmer5.0设计特异性引物，引物序列为：f：5′-ggagacagcggtatcgtag-3′和r：5′-ggttcattgacgctaggaggaa-3′，用于扩增约510bp的聚合酶1b蛋白基因片段，引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。

利用axypreprna提取试剂盒提取鸡ⅰ型星状病毒核酸rna，按照primescript™onesteprt-pcrkitver.2(dyeplus)推荐的50μl体系进行rt-pcr反应，其中primescript1stepenzymemix反应液2μl、2×1stepbuffer（dyeplus）反应液25μl、上下游引物（f和r，10μm）各2μl、提取的核酸rna2μl，补充灭菌去离子水至终体积50μl。反应条件为：50℃反转录30min后进行pcr扩增程序；94℃预变性4min；94℃50s，56℃30s，72℃35s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min。

rt-pcr结束后琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照peasy-t1simplecloningkit克隆连接试剂盒说明书将rt-pcr扩增的特异性聚合酶1b蛋白基因片段克隆到peasy-t1克隆载体上，进行蓝白斑筛选，酶切正确的克隆送南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序。将测序结果在ncbi上进行blast分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为pcr的阳性标准品（t-castvⅰ），分装后置于-20℃保存备用。

3.4.2lamp灵敏度检测

对鸡ⅰ型星状病毒构建的阳性标准品（t-castvⅰ）进行连续稀释（质粒浓度分别为1.35×10⁴，1.35×10³，1.35×10²，1.35×10¹和1.35×10⁰拷贝/μl），按照优化后的lamp条件进行检测，获得其敏感性试验数据。

3.5lamp方法临床样品的检测

建立的lamp检测方法的临床应用对本实验室收集的49份鸡组织病料经研磨处理后，按照axyprep总rna小量制备试剂盒按照说明书方法进行操作提取鸡星状病毒的rna，按照传统方法将提取的核酸rna反转录为cdna。反转录体系同上，按照优化后的lamp条件进行检测。

lamp反应体系为25.0μl：2×反应缓冲液12.5μl,引物f3(25pmol)1.0μl,引物b3(25pmol)1.0μl，引物fip(50pmol)0.5μl,引物bip(50pmol)0.5μl,bstdna聚合酶1μl，待检样品cdna模板1.0μl，甜菜碱终浓度为4mol/l，荧光目视检测试剂sybrgreenⅰ荧光染料1.0μl，其余用超纯水补足至25.0μl，然后于64℃反应40min。

二、实验结果

2.1结果观察

经紫外线照射装置（350-370nm）照射可见，阳性样品鸡ⅰ型星状病毒（castvyz2017-2株）发出翠绿色的荧光，对照样品（鸡新城疫病毒、家禽腺病毒、禽白血病病毒、鸡马立克氏病毒和鸡传染性支气管炎病毒）均未见可见荧光（见图1）。

1.2lamp检测灵敏度

经紫外线照射装置（350-370nm）照射可见，鸡ⅰ型星状病毒的浓度在1.35×10²copy/μl（即135copy/μl）（见图2）时为最低检测限。将结果进行常规琼脂糖凝胶电泳可见，在1.35×10⁴copy/μl、1.35×10³copy/μl、1.35×10²copy/μl（即135copy/μl）均可见有不连续梯状电泳条带；在1.35×10¹copy/μl、1.35×10⁰copy/μl和阴性对照均未见有不连续梯状电泳条带。可见，本发明的lamp的最低检测限为135copy/μl。

1.3临床样本的lamp检测结果

将本实验室收集的49份鸡组织病料经研磨处理后，按照商品化试剂盒提取相应的基因组dna，按照优化后的lamp条件进行检测。结果可见，阳性样品为17份，阳性率为34.69%（17/49）。且pcr检测的阳性样品（17份）用本发明建立的lamp方法的检测结果均为阳性，阳性符合率为100%（17/17）。将相关阳性样品利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收后克隆测序。将测序结果在ncbi上进行blast分析验证，均为相应的鸡ⅰ型星状病毒基因片段，均符合试验预期。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

<110>扬州大学

<120>鸡ⅰ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组、试剂盒以及其检测方法

<160>4

seqidno.1

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcgacgtaggaccttaggt19

seqidno.2

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cccctacataacggttgctc20

seqidno.3

<210>3

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

acagtgtcaggctcgtaggtcaataggtgatgacaggctcct42

seqidno.4

<210>4

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tctttgggatgtgggtgaagcccatcccacagaacgagagac42