一种检测ATP7B基因突变的引物组合、检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测atp7b基因突变的引物组合、检测方法及试剂盒。

背景技术

atp7b基因位于人类13号染色体长臂的1区4带第3亚带(13q14.3)，其grch38版本基因组坐标为：chr13:51,932,668-52,012,129，全长79461bp，包含21个外显子和20个内含子。atp7b基因编码一种铜转运p型atp酶，参与人体内铜离子的跨膜转运。目前，国内外学者一致认为atp7b基因是肝豆状核变性的致病基因，该基因被收录进在线人类孟德尔遗传数据库，收录编号为omim*606882。atp7b基因突变可导致atp酶功能减弱或丧失，引起血清铜蓝蛋白(ceruloplasmin)合成减少以及胆道排铜障碍，蓄积于体内的铜离子在肝、脑、肾、角膜、肠道等处沉积，引起进行性加重的肝硬化、锥体外系症状、精神症状、肾损害及角膜色素(kayser-fleischerring，k-f)环等典型的肝豆状核变性症状。

肝豆状核变性又称wilson病，是至今少数几种可治的神经遗传病之一，关键是早发现、早诊断、早治疗，如不恰当治疗将会致残甚至死亡。传统的诊断肝豆状核变性的方法包括血清铜蓝蛋白检测、血清铜和尿铜的检测、眼底k-f环以及肝脏功能的检测等，但由于本病起病隐匿，受累器官多，首发症状不一，且早期症状不典型，早期诊断较为困难，极容易误诊和漏诊，我们的研究结果显示，肝豆状核变性患者从首次发病至明确诊断中位病程为5个月，52.1％的患者在起病5个月之后才得以明确诊断，最长的起病82个月后才表现出典型的症状而得以确诊。显然，传统的方法对于本疾病的早期识别能力有限。

近年来，国内外学者认识到atp7b基因突变检测对早期识别肝豆状核变性的重要意义，欧洲肝脏病学会发布的《wilson病临床诊疗指南》以及我国的《肝豆状核变性的诊断与治疗指南》均推荐atp7b基因突变检测可用于肝豆状核变性患者的评估和患者家系成员的早期筛查。目前收录在美国ncbi临床疾病相关变异数据库(clinvar数据库)的atp7b基因致病的和可能致病的突变有172个，分布在1～21号外显子以及部分内含子的剪接区。另外，atp7b基因突变具有明显的人群异质性和个体多样性，文献报道欧洲以his1069gln为主(占35％～45％)、印度和中东分别以cys271stop(占20％)和gln1399arg(占30％)为主，而我国以arg778leu、pro992leu和ala874val为主(累计占27％～48％)。除了3个主要的突变，我们在我院的肝豆状核变性患者中检出met769hisfsx26、ile1148th、arg919gly、tyr715stop等18个致病突变，其中13个为新发现的致病突变，并且文献报道不断有新的致病基因发现(lix,etal.bmcmedgenet2011,12:6)。因此，atp7b基因突变的异质性和个体差异性，决定了atp7b基因突变检测需要覆盖本基因的所有外显子及内含子剪接区，才能准确的、全覆盖的识别atp7b的致病突变。

国内外已有的基因突变检测方法包括聚合酶链反应限制性单链构象多态性技术(pcr-sscp)、聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(pcr-rfpl)、实时荧光定量聚合酶链反应(rt-qpcr)、sanger测序、二代高通量测序等。前三种方法只能一次性检测一个位点、难以对整个基因的潜在位点全部检出，目前应用在atp7b基因突变的检测也多局限于常见位点arg778leu、pro992leu和ala874val的检测，对于其他位点和新的突变位点无法检出，可出现50％以上的假阴性；二代高通量测序价格昂贵，从建库、测序到生物信息学分析技术要求高，普通实验室难以开展，将二代测序这一高通量技术用于单个基因的检测非常的浪费，并且二代高通量测序检出的突变位点可出现假阳性，其准确性需要sanger测序的验证。而sanger测序是检测基因突变的金标准。因此，本发明采用直接sanger测序的方法，针对atp7b基因的全部的21个外显子和剪接区，设计了特异性的引物，开发建立了一种快速检测atp7b基因突变的引物组合、检测方法和试剂盒，可用于快速检测覆盖atp7b基因全部外显子区和剪接区的已知突变和未知突变，该方法快速、准确性高、价格便宜、操作简单、普通实验室即可开展。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测atp7b基因突变的引物组合、检测方法及试剂盒，能够快速、准确地检测atp7b基因突变情况。且价格便宜、操作简单、普通实验室即可开展。

本发明为实现上述目的提出的一种技术方案是：即一种检测atp7b基因突变的引物组合，包括检测atp7b基因21个外显子和剪接区的25对pcr扩增用引物，所述引物的碱基序列为seqidno.1～seqidno.50所示。

本发明提供的试剂盒包括碱基序列为seqidno.1～seqidno.50的引物组，pcr缓冲液、dna聚合酶、dntp和mgcl2等。

本发明另一方面提供一种检测atp7b基因突变的检测方法，包括(1)提取样本dna步骤；(2)pcr扩增步骤；(3)将pcr扩增产物进行电泳的步骤；(4)对pcr产物进行毛细管电泳测序；(5)以及采用bioedit、mega、chromas或者consed比对分析软件，对测序序列与人类基因组中atp7b基因的参考序列进行比对分析，找出该样本atp7b基因外显子1～21及剪接区的所有突变位点。通过以上方法获得待检样品的基因突变结果。

所述检测方法的pcr扩增体系为：

所述扩增体系也可以是上述体系的倍比体积或等浓度体系。

优选的，引物对seqidno.1-4，seqidno.7-8，seqidno.13-14，seqidno.25-26的pcr扩增条件为：95℃2min；95℃30s，59.5℃(-0.5℃/循环)30s，72℃40s，13个循环；95℃30s，53℃30s，72℃40s，32个循环；72℃7min；4℃∞。

更优选的，引物对seqidno.5-6，seqidno.9-12，seqidno.15-24，seqidno.27-50的pcr扩增条件为：95℃2min；95℃30s，61.5℃(-0.5℃/循环)30s，72℃40s，13个循环；95℃30s，55℃30s，72℃40s，32个循环；72℃7min；4℃∞。

本发明采用特异性的引物，可特异性地检测atp7b基因的突变。本发明的特异性引物覆盖atp7b基因的所有外显子和剪接区，与传统的聚合酶链反应限制性单链构象多态性技术(pcr-sscp)、聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(pcr-rfpl)、实时荧光定量聚合酶链反应(rt-qpcr)只能一次性检测单个或某几个突变位点相比，本发明可一次性检测atp7b基因的所有外显子和剪接区的突变，操作简单、效率高，并避免了这3种传统方法的假阴性高的问题。与新兴的二代高通量测序相比，本发明价格便宜、准确性高、避免了二代高通量测序假阳性问题，且没有建库、高级生物信息学分析等步骤，操作简单、普通实验室即可开展。

附图说明

图1为合格的dna样本示意图；

图2为本发明25对引物对atp7b基因进行pcr扩增的条带示意图；

图3为本发明的测序结果鉴定atp7b基因突变位点的示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明的实施方案进行详细的描述。应理解，这些实施例意在说明实施本发明的现已知的一个最佳的实施方案，但是不应该认为本发明局限于这些实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域技术人员熟知的常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1特异性引物设计与合成

从gnebank下载atp7b基因的人类参考基因序列，根据注释文件对atp7b基因的转录起始、翻译起始、21个外显子、20个内含子以及剪接区进行注释，针对atp7b基因全部的外显子和剪接区设计特异性引物共25对。并通过特异性引物以及pcr扩增体系和条件的优化，以提高检测灵敏度和效率。优化后引物如下：

实施例2检测样本处理和dna提取

本发明的检测样本可以是全血、血凝块、新鲜病理组织、石蜡包埋组织，本实施例仅以全血样本为例进行说明。

为减少各种抗凝剂对pcr反应的干扰，应采用edta-k2抗凝的采血管采集静脉血，静脉血应当天进行dna的提取和纯化，如果当天不能及时提取，则应放4℃冰箱保存。可采用dna提取试剂盒或者全自动dna提取仪等常规dna提取纯化的方法进行。于nanodrop2000微量核酸蛋白检测仪检测dna浓度，测定260/280比值以及260/230比值。所提dna经0.5％琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的电泳条带，长度大于20kb，无明显降解(如图1所示)，且样本浓度大于10ng/μl、260/280控制在1.8-2.0之间视为合格。dna短期保存可存于4℃，长期保存需至于-20℃或-70℃冰箱。

实施例3建立pcr扩增反应体系及反应条件1

对于seqidno.1-4，seqidno.7-8，seqidno.13-14以及seqidno.25-26共5个引物对，按照以下扩增体系和条件进行pcr扩增，也可按照以下体系的倍比体积或等浓度体系进行扩增：

优选的，pcr扩增条件为：95℃2min；95℃30s，59.5℃(-0.5℃/循环)30s，72℃40s，13个循环；95℃30s，53℃30s，72℃40s，32个循环；72℃7min；4℃∞。即退火过程采用touch-down的方法，以59.5℃退火30秒开始，每个循环降低0.5℃，共13个循环；再以53℃退火30s共32个循环。

实施例4建立pcr扩增反应体系及反应条件2

对于seqidno.5-6，seqidno.9-12，seqidno.15-24，seqidno.27-50共20个引物对，按照以下扩增体系和条件进行pcr扩增，也可按照以下体系的倍比体积或等浓度体系进行扩增：

优选的，pcr扩增条件为：95℃2min；95℃30s，61.5℃(-0.5℃/循环)30s，72℃40s，13个循环；95℃30s，55℃30s，72℃40s，32个循环；72℃7min；4℃∞。即退火过程采用touch-down的方法，以61.5℃退火30秒开始，每个循环降低0.5℃，共13个循环；再以55℃退火30s共32个循环。

实施例5本发明试剂盒的使用方法

(1)dna模板准备：采用常规方法提取样本dna，质检合格后放冰箱4℃暂时存放。对于冻存dna于用前从-20℃或-70℃冰箱取出解冻，然后置于冰上。

(2)试剂准备及批量配置：酶取出置冰上，引物及其他试剂取出解冻。如果一次性做多个样本，可按需求配置引物混合物以及酶混合物。以一次性做48个样本为例，需配置大概50人份的引物混合物和酶混合物，按25μl体系计算所需具体配比如下：

50人份引物混合物配比：

浓度为20μm的正向引物15μl

浓度为20μm的反向引物15μl

ddh2o470μl

混匀，置冰上备用。

50人份酶混合物配比：

混匀，置冰上备用。

(3)加样：优选的，按25μl体系加样，即取样本dna模板2μl、上述引物混合物10μl、上述酶混合物13μl加入pcr管。混匀。也可以按10μl、12.5μl以及50μl等体系加样，按倍比调整各试剂的加样量即可。

(4)扩增：加样完成后，对pcr管可瞬时离心将样本和试剂聚于管底，取出pcr管置于pcr扩增仪上进行扩增。对于seqidno.1-4，seqidno.7-8，seqidno.13-14以及seqidno.25-26共5个引物对，pcr扩增条件为：95℃2min；95℃30s，59.5℃(-0.5℃/循环)30s，72℃40s，13个循环；95℃30s，53℃30s，72℃40s，32个循环；72℃7min；4℃∞。对于seqidno.5-6，seqidno.9-12，seqidno.15-24，seqidno.27-50共20个引物对，pcr扩增条件为：95℃2min；95℃30s，61.5℃(-0.5℃/循环)30s，72℃40s，13个循环；95℃30s，55℃30s，72℃40s，32个循环；72℃7min；4℃∞。得到的扩增产物4℃保存。

(5)电泳：取1μlpcr扩增产物，加入dna染料，经1-2％琼脂糖凝胶电泳，电压设定80-100v，可见清晰的电泳条带。如图2所示。

(6)测序：采用常规方法对pcr产物进行毛细管电泳测序，也即sanger测序。

(7)测序结果分析和突变位点解读：采用bioedit、mega、chromas或者consed等比对分析软件，对测序序列与人类基因组中atp7b基因的参考序列进行比对分析，找出位该样本atp7b基因外显子1～21及剪接区的所有突变位点。然后对突变位点在美国ncbi临床疾病相关变异数据库(clinvar数据库，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)以及加拿大ualberta大学的wilson疾病数据库(网址：http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/search3.asp？a＝a)进行查询比较，以明确该突变是致病性的(pathogenic)、良性的(benign)、不确定的(uncertain)或者是未知的新位点。并可根据样本检出的突变是纯合还是杂合，以及可能的父母的突变情况，判断样本的突变是在一条染色体上还是2条染色体上，并进一步可进行评分，根据2001年第8届莱比锡国际会议wilson病大会制定的诊断评分系统，2条染色体上均有atp7b基因突变得2分，1条染色体上有atp7b基因突变得1分。图3为本发明检测患者atp7b基因突变位点c.2333g>t(氨基酸改变为p.arg778leu)的示意图，最上方是参考序列，中间是杂合突变患者，最下方是纯化突变患者。

综上所述，本发明开发建立了一种快速检测atp7b基因突变的引物组合、检测方法和试剂盒，可用于快速检测覆盖atp7b基因全部外显子区和剪接区的已知突变和未知突变，该方法快速、准确性高、价格便宜、操作简单、普通实验室即可开展。

<110>中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120>一种检测atp7b基因突变的引物组合、检测方法及试剂盒

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<170>patentinversion3.3

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