一种Src抑制剂及其应用的制作方法

本发明涉及抗肿瘤技术领域，尤其是一种src抑制剂。

背景技术：

src是一种非受体酪氨酸激酶，目前大量研究表明src在癌症发生发展中的表达或活性升高。src参与维持正常的细胞内环境稳定和广泛的生理功能，除细胞增殖外，src蛋白还调节细胞的粘附、侵袭和迁移，被认为与肿瘤的进展和转移有关。此外，抑制src的表达或活性具有抗肿瘤的效应，抑制src发挥抗肿瘤的作用。达沙替尼、塞卡替尼等多种src激酶抑制剂已经在多种肿瘤中被广泛应用。

二氢丹参酮ⅰ来源于唇形科植物丹参(salviamiltiorrhizabge)根茎，是丹参的主要活性成分之一，既往报道其具有抑制多种肿瘤增殖等作用。但是未见二氢丹参酮ⅰ是src抑制剂或者具有抑制src作用的报道。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供二氢丹参酮ⅰ的一种新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种酪氨酸激酶抑制剂，其为二氢丹参酮ⅰ。

作为上述方案的进一步优化，所述二氢丹参酮ⅰ的作用浓度为0.3125μm以上。

作为上述方案的进一步优化，所述二氢丹参酮ⅰ的作用浓度为2.335μm以上。

作为本发明的另一个方面，本发明提供了二氢丹参酮ⅰ作为酪氨酸激酶抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

作为上述方案的进一步优化，所述肿瘤为肝癌。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明中二氢丹参酮ⅰ来源于唇形科植物丹参(salviamiltiorrhizabge)根茎，是丹参的主要活性成分之一，能够有效抑制src的活性，且成本较低，因此可作为一种有前景的src抑制剂药物。

附图说明

图1为二氢丹参酮ⅰ的分子式；

图2为二氢丹参酮ⅰ-src复合物的三维丝带模型；

图3显示与二氢丹参酮ⅰ相互作用的氨基酸残基；

图4为在0ns和80ns时二氢丹参酮ⅰ-src复合物络合物表面模拟模型；

图5为未结合的src(蓝色)和二氢丹参酮ⅰ-src复合物(红色)的重原子的均方根偏差(rmsd)检测结果图；

图6为二氢丹参酮ⅰ对重组src活性影响的检测结果图；

图7为二氢丹参酮ⅰ对三种人源肝癌细胞src蛋白磷酸化影响的检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种src抑制剂，所述抑制剂为二氢丹参酮ⅰ。本申请的发明人经多次实验发现二氢丹参酮ⅰ能与src酶活性位点稳定结合；进一步地，二氢丹参酮ⅰ能与src的met-341，thr-338之间形成2个氢键结合。

在一个具体实施方案中，所述二氢丹参酮ⅰ的浓度为0.3125μm以上。本申请的发明人经多次试验发现，当二氢丹参酮ⅰ的浓度为0.3125μm以上时，对重组src蛋白的活性有显著的抑制效果。本申请的发明人还发现，二氢丹参酮ⅰ的对重组src蛋白活性的半数抑制浓度(ic50)为2.335μm。

本申请的发明人采用计算机模拟辅助筛选技术分子对接及分子动力学揭示二氢丹参酮ⅰ在空间上能够稳定的结合src激酶的活性区域，此外，在体外酶活性实验中，二氢丹参酮ⅰ能够抑制非受体酪氨酸激酶src活性，并随着药物浓度的增加，抑制效果越明显；在细胞层面通过westernblot检测，发现二氢丹参酮ⅰ可以降低src的磷酸化水平，由此推断二氢丹参酮ⅰ是一种天然的src激酶抑制剂。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本申请中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域的通用方法。如无特别说明，本发明中的试剂或试剂盒均可从市场上或其它公开渠道获得。

实施例1分子动力学技术证实二氢丹参酮ⅰ可以稳定结合src激酶

发明人采用分子对接软件autodockvina以及分子动力学软件yasara进行分子对接及分子动力学模拟。分子对接模拟发现src和dhi之间的结合能为-9.831kcal/mol。

如图1～5所示，图1为二氢丹参酮ⅰ的结构分子式；图2所示为src-二氢丹参酮ⅰ复合物的三维丝带模型；图3显示src和二氢丹参酮ⅰ的met-341，thr-338之间形成了两个氢键，还通过范德华力与tyr340、leu273、gly344、val281、lys295、leu393、val323、ala293相互作用。

src-二氢丹参酮ⅰ复合物在0ns和80ns处的表面可视化模型如图4所示。src稳定地出现在src结合位点的中心，直到md模拟结束。src蛋白的均方根偏差(rmsd)在0-80ns期间稳定在左右波动((图5，红线)。未结合src的rmsd在前5ns逐渐上升到在5-80ns期间稳定在左右波动(图5，蓝线)。

这些分子模拟结果表明二氢丹参酮ⅰ可能与src蛋白直接结合。

实验例2二氢丹参酮ⅰ能够抑制酪氨酸激酶src活性

本实施例采用重组src蛋白与二氢丹参酮ⅰ直接作用。我们在体外用通用酪氨酸激酶活性试剂盒进一步检测到二氢丹参酮ⅰ能够抑制非受体酪氨酸激酶src的活性，并随着药物浓度的增加，抑制效果越明显。实验结果如图6所示，二氢丹参酮ⅰ抑制酪氨酸激酶src活性的ic50为2.335μm，最低起效浓度为0.3125μm。由此推测二氢丹参酮ⅰ主要是通过抑制非受体酪氨酸激酶src，从而发挥抗肝细胞癌的作用。

实验例3二氢丹参酮ⅰ能够降低src的磷酸化水平

选用三种人源肝癌细胞sk-hep1，hep3b和smmc-7721，选用不同浓度的二氢丹参酮ⅰ(1.5μm，2μm，2.5μm)处理细胞24h后，同时设立正常对照组(0.1％dmso)，westernblot检测p-src、src的表达。其中，涉及的抗体包括兔抗人src抗体(1：1000，购自cst公司)、兔抗人p-src抗体(1：1000，购自cst公司)和兔抗人gapdh(gapdh抗体购自cst公司，1：5000)(例数＝3)。

结果如图7a-b所示，在sk-hep1、hep3b和smmc-7721细胞中，二氢丹参酮ⅰ能够抑制p-src的表达，具有浓度依赖性，即1.5μm，2μm，2.5μm能够p-src的表达，差异具有统计学意义(p<0.05)。

综合上述实施例1～3的实验结果最终得出结论：基于计算机模拟筛选辅助技术揭示二氢丹参酮ⅰ与src激酶有着较强的结合能力，具有稳定的结合性，另外，在体外酶活性试剂盒中，检测重组src蛋白与二氢丹参酮ⅰ的作用关系发现，二氢丹参酮ⅰ浓度依赖性地抑制src的活性。细胞层面通过westernblot检测其蛋白表达情况，验证了二氢丹参酮ⅰ可有效地降低src的磷酸化水平，是有效的天然src抑制剂。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。