检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法与流程

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。

背景技术：

鸡传染性支气管炎(infectiousbronchitis，ib)是由鸡传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus，ibv)引起的一种急性和接触性呼吸疾病，传染性和致病性均很强。ibv是有囊膜、不分节段的单股正链rna病毒，属于冠状病毒科γ冠状病毒属，其基因组不稳定，极容易发生点突变、缺失、插入等，导致基因变异株不断被分离。除此之外，ibv血清型众多，不同血清型、基因型间交叉保护很弱，使得免疫控制ib的效果一直不理想，发病率较高。肉鸡感染ibv后可导致生长缓慢以及饲料利用率下降，蛋鸡感染ibv后可导致产蛋量和蛋品质下降，均对养鸡产业有着极大的威胁与破坏性。

ib的临诊症状和病理变化与鸡新城疫、禽流感、鸡传染性喉气管炎相似，易发生误诊。目前对于ibv的检测方法主要有病毒分离鉴定、rt-pcr-琼脂糖凝胶电泳法、elisa、环介导等温核酸扩增等方法，但上述方法往往需要昂贵的设备和专业的操作人员，检测成本高，操作条件苛刻，非常不便于基层兽医使用。

技术实现要素：

针对现有ibv的检测方法检测成本高，操作条件苛刻的问题，本发明提供了用于检测传染性支气管炎病毒的引物和探针组合。

以及，本发明还提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒。

以及，本发明还提供了检测鸡传染性支气管炎病毒的方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

用于检测传染性支气管炎病毒的引物和探针组合，所述引物的序列(如seqidno.1～2所示)为：

上游引物：5′-cgtcttataactggtagattgtcatcactc-3′；

下游引物：5′-attaccacaaaaggagtacctagtagactg-3′；

所述探针的序列(如seqidno.3所示)为：5′-gtcacaacagcgtgagttagccacgcaaaag-thf-attaatgagtgtgtta-3′。

本组合中的引物为等温扩增引物，以ibv的s2基因(genbank：ef602461.1)序列为基础而设计得到，含有鸡传染性支气管炎病毒rna片段的待测物利用上述引物可通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(rt-raa)在等温条件下进行大量扩增，不需对ibv模板反转录，在25min内即可完成目的基因片段的扩增。经凝胶电泳检测，所得的扩增产物条带单一、清晰，且大小符合目的片段，而不含鸡传染性支气管炎病毒rna片段的待测物则不会产生扩增。经敏感性试验验证，利用该组合中的引物进行扩增后对ibv最低检测限为10²拷贝/μl，为普通pcr(10⁴拷贝/μl)灵敏度的100倍。

该探针基于上述下游引物而设计，探针上距离5′端31bp位置有一个碱基缺口，并以四氢呋喃(thf)残基修饰(seqidno.3中r即为thf)，当探针为单链时核酸内切酶不识别，只有当探针和上述引物扩增所得的扩增产物中的目的片段结合后核酸内切酶才开始工作，形成双标记的产物，从而可提高该检测方法的特异性，使其他病毒对检测结果无干扰。

以及，本发明实施例还提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，包含上述引物和探针组合。使用该试剂盒进行鸡传染性支气管炎病毒的检测对检测设备和操作人员要求低，操作简便，检测成本低，并具有特异性好、灵敏度高的优点。

优选地，所述探针5′端以生物素和荧光基团修饰，3′端以磷酸基团修饰，扩增完成后可通过荧光反应进行鉴别。

优选地，所述试剂盒还包括荧光基础缓冲液和乙酸镁。二者均可选择用于rt-raa核酸扩增的市售试剂，如江苏奇天基因生物科技有限公司的rt-raa核酸扩增试剂。

以及，本发明实施例还提供了上述检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒的使用方法，具体操作为：提取待测物的基因组，用上述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，扩增完成后进行荧光检测。该方法用上述试剂盒可实现鸡传染性支气管炎病毒的快速检测，反应简单、快速，不需要高温循环，在有大量样品的非实验室检测场所同样适用，能够满足基层兽医的使用需求。

优选地，所述重组酶介导等温扩增的反应体系为：

反应温度为35～41℃，反应时间20～24min。该扩增的反应体系简单、反应条件参数少，易于操作和控制，便于在多种场合进行操作，对试验场地要求低。

优选地，所述反应温度为37～39℃。

优选地，用胶体金侧向流免疫层析试纸条(lfd)进行荧光检测。将lfd与rt-raa结合后构成的rt-raa-lfd检测方法能够方面、快捷地检测出待测物中的ibv。

附图说明

图1为本发明实施例3中各待测物的lfd试纸条检测结果；

图2为本发明实施例3～10中ibv标准毒株的lfd试纸条检测结果；

图3为本发明检验例1中普通pcr的检测结果，图中，3-1为10⁷拷贝/μl，3-2为10⁶拷贝/μl，3-3为10⁵拷贝/μl，3-4为10⁴拷贝/μl，3-5为10³拷贝/μl，3-6为10²拷贝/μl，3-7为10¹拷贝/μl，3-8为10⁰拷贝/μl，3-9为阴性对照。

图4为本发明检验例1中rt-raa-lfd的检测结果，图中，4-1为10⁶拷贝/μl，4-2为10⁵拷贝/μl，4-3为10⁴拷贝/μl，4-4为10³拷贝/μl，4-5为10²拷贝/μl，4-6为10¹拷贝/μl，4-7为10⁰拷贝/μl，4-8为阴性对照。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明实施例提供了用于检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针组合，序列分别为：

上游引物：5′-cgtcttataactggtagattgtcatcactc-3′；

下游引物：5′-attaccacaaaaggagtacctagtagactg-3′；

探针：5′-gtcacaacagcgtgagttagccacgcaaaag-thf-attaatgagtgtgtta-3′。

实施例2

本发明实施例提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，具体包括：

(1)等温扩增引物和探针：序列分别为：

上游引物：5′-cgtcttataactggtagattgtcatcactc-3′；

下游引物：5′-attaccacaaaaggagtacctagtagactg-3′；

探针：5′-gtcacaacagcgtgagttagccacgcaaaag-thf-attaatgagtgtgtta-3′，5′端以生物素和荧光基团修饰，3′端以磷酸基团修饰。

(2)荧光基础缓冲液、乙酸镁(均为江苏奇天基因生物科技有限公司的rt-raa核酸扩增试剂)。

实施例3

本发明实施例提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

各待测物分别为：

ibv标准毒株(av1511)、鸡传染性喉气管炎病毒(infectiouslaryngotracheitisvirus，iltv)标准强毒王岗株(av195)，购自中国兽医药品监察所；禽流感(avianinfluenzavirus，aiv)、鸡新城疫病毒(newcastlediseasevirusvirus，ndv)，均为河北农业大学实验室临床检测后保存。阴性对照用纯水代替模板。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

用dna/rna提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的基因组，以ibv、ndv、aiv的rna、iltv的dna为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：

反应条件为：37℃反应24min。

(2)荧光染色

取10μl的步骤(1)所得扩增产物滴加到lfd试纸条(购自杭州优思达生物科技公司，设有fam抗体检测线和biotin抗体质控线)的检测区，并将试纸条插入加有100μltris缓冲液(25mmol/ltris、150mmol/lnacl和0.05％tween-20)的2ml离心管内，3min后观察结果。

试纸条判定标准：出现两条红带为阳性，且两条带一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明样本中含有ibv核酸片段；如果质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明不含有ibv片段。

结果如图1所示，只有含鸡传染性支气管炎病毒rna片段的待测物呈现阳性结果，其他病毒均呈现阴性结果，可见本发明提供的检测鸡传染性支气管炎病毒的方法具有良好的特异性。

实施例4

本发明实施例提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

ibv标准毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

用dna/rna提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的基因组，以ibv的rna为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：

反应条件为：37℃反应24min。

(2)荧光染色同实施例3。

实施例5

本发明实施例提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

ibv标准毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

用dna/rna提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的基因组，以ibv的rna为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：

反应条件为：37℃反应24min。

(2)荧光染色同实施例3。

实施例6

本发明实施例提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

ibv标准毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

用dna/rna提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的基因组，以ibv的rna为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：

反应条件为：37℃反应24min。

(2)荧光染色同实施例3。

实施例7

本发明实施例提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

ibv标准毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

反应体系同实施例3，反应条件为：35℃反应24min。

(2)荧光染色同实施例3。

实施例8

本发明实施例提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

ibv标准毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

反应体系同实施例3，反应条件为：39℃反应24min。

(3)荧光染色同实施例3。

实施例9

本发明实施例提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

ibv标准毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

反应体系同实施例3，反应条件为：41℃反应24min。

(2)荧光染色同实施例3。

实施例10

本发明实施例提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

ibv标准毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

反应体系同实施例3，反应条件为：37℃反应20min。

(2)荧光染色同实施例3。

实施例3～实施例10的ibv标准毒株lfd试纸条检测结果如图2所示。

检验例1

本检验例对上述鸡传染性支气管炎病毒的检测方法进行了敏感性实验

1、重组质粒标准品的制备

提取的ibv基因组rna，将其反转录得到模板cdna。按以下反应体系进行pcr扩增：

反应程序为：94℃，5min；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。胶回收pcr产物，将纯化后的目的片段连接到t-vectorpmdtm20质粒(购自takara公司)，纯化筛选后，构建标准质粒，测定核酸含量后，根据下列公示计算标准质粒所含dna拷贝数。

质粒拷贝数(拷贝/l)＝[质粒浓度(g·μl^-1)×6.02×10²³]/[总片段长度(bp)×660g/mol]

总片段长＝载体长度(bp)+片段长度(bp)

2、rt-pcr与rt-raa-lfd敏感性比较

将构建的标准质粒稀释为10⁰～10⁷拷贝/μl梯度浓度，比较ibv普通pcr方法和rt-raa-lfd方法的敏感性。

普通pcr为25μl体系：2×gflex^tmpcrbuffer(mg²⁺，dntpplus)12.5μl，上、下游引物(10μm)各0.5μl，tksgflex^tmdnapolymerase(1.25units/μl)0.5μl，模板1μl，其余用纯化水补齐。反应程序按照：94℃1min，98℃10s，55℃15s，68℃30s，30个循环后68℃延伸5min。

rt-raa反应体系和条件同实施例3。

以上各反应体系中的模板为10⁰～10⁷拷贝/μl梯度浓度的标准质粒。

结果如图3、图4所示，普通rt-pcr检出限为10⁴拷贝/μl，rt-raa-lfd检出限为10²拷贝/μl。rt-raa-lfd方法敏感性远高于普通pcr，是普通pcr的100倍。

检验例2

用实施例3中的检测方法和普通pcr方法分别检测临床诊断中疑似ibv病料57份，比较两种方法的符合率。

利用rt-raa-lfd方法检测临床鸡呼吸道症状疑似ib病料57份，阳性结果48份，阴性结果为9份；用普通pcr方法检测阳性结果43份，阴性结果15份。rt-raa-lfd方法检出率高于普通rt-pcr，两种方法的符合率为91％，表明本研究建立的rt-raa-lfd方法可用于ibv的现场检测。

由以上结果可见，本发明所提供的检测方法在检测鸡传染性支气管炎病毒方面具有良好的特异性，灵敏度高，且操作简便、便于观察。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>河北农业大学

<120>检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法

<130>2019.8.9

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>上游引物

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<211>48

<212>dna

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<400>3

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