一种无血清绵羊肺炎支原体抗原的制备方法与流程

本发明属于兽医生物技术
技术领域：
，具体涉及一种无血清绵羊肺炎支原体抗原的制备方法。
背景技术：
：绵羊肺炎支原体可引起绵羊和山羊的肺炎，临床上主要以流鼻涕、咳嗽等症状为主。绵羊肺炎支原体在羊群中广泛存在，正常羊上呼吸道也可分离出该病原。当天气变化、运输等应激刺激或继发其他细菌或病毒时，症状往往会加重。近年来，我国羊场绵羊肺炎支原体引起的或继发的疫病增多，严重威胁养羊业的健康发展。绵羊肺炎支原体抗原培养目前主要使用改良km2培养基、改良thiaucourt's培养基等。现有培养基培养绵羊肺炎支原体抗原，培养基中需添加血清，培养基血清含量一般在5％-20％之间。培养基血清的添加对于绵羊肺炎支原体的培养至关重要。然而，由于使用血清存在很多问题，如血清批次差异较大，价格昂贵，易污染一些支原体等微生物，后期需要复杂工艺去除血清复杂成分，同时，血清去除不干净或含血清抗原会增加疫苗副反应，影响免疫效果等。因此，低血清或无血清制备绵羊肺炎支原体抗原具有重要的研究和实际意义。目前，未有无血清制备绵羊肺炎支原体抗原的报道。技术实现要素：为解决现有技术使用血清存在的诸多问题，本发明旨在提供一种无血清制备绵羊肺炎支原体抗原的方法。本发明通过将绵羊肺炎支原体在鸡胚传代培养，收取鸡胚尿囊液，获得不含血清的绵羊肺炎支原体抗原。本发明方法不使用血清，可避免使用血清所存在的诸多问题。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：本发明提供一种无血清绵羊肺炎支原体抗原的制备方法，步骤如下：(1)鸡胚准备：准备7-8日龄的健康spf鸡胚，鸡胚活力旺盛、血管清晰，孵化箱培养；(2)绵羊肺炎支原体接种液准备；(3)鸡胚接种、培养与收获：将绵羊肺炎支原体接种液接种步骤(1)的7-8日龄的健康spf鸡胚，每枚鸡胚接种0.2ml，接种后，孵化箱继续培养5d，无菌收获死亡鸡胚尿囊液和/或5d后仍未死亡鸡胚尿囊液，得到无血清绵羊肺炎支原体抗原。作为优选，步骤(1)和步骤(2)的顺序互调。作为优选，步骤(2)中，所述绵羊肺炎支原体接种液准备的具体方法为：复苏绵羊肺炎支原体菌株，37℃温箱培养并传代，生理盐水离心洗涤培养菌液，等体积生理盐水重悬，获得绵羊肺炎支原体接种液。作为优选，步骤(3)中，所述接种健康spf鸡胚的方法为卵黄囊接种，接种量为每枚鸡胚接种0.2ml。作为优选，步骤(3)中，孵化箱的培养条件为温度37.0～37.5℃，湿度50％。作为优选，步骤(3)后，还包括以下步骤：(1)用生理盐水稀释鸡胚尿囊液，得到鸡胚尿囊液稀释液，对鸡胚尿囊液稀释液继续接种7-8日龄的健康spf鸡胚传代1次，无菌收获死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液；(2)再次用生理盐水稀释鸡胚尿囊液，得到稀释液，将稀释液经尿囊腔接种健康spf鸡胚并收获接种后死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液；或将10-1稀释尿囊液经卵黄囊接种健康spf鸡胚，无菌收获接种后死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液；获得绵羊肺炎支原体无血清抗原。本发明提供上述的一种无血清绵羊肺炎支原体抗原的制备方法在绵羊肺炎支原体培养中的应用。本发明提供上述的一种无血清绵羊肺炎支原体抗原的制备方法在绵羊肺炎支原体疫苗抗原制备中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果包括：制备绵羊肺炎支原体抗原中不含有动物血清成分，操作方便简单等优点。本发明可克服现有技术使用动物血清存在诸多问题，如血清的批次来源影响质量控制、生物安全、血清易污染支原体等，后期繁杂纯化工艺去除血清复杂成分、动物血清成分增加不良反应和影响疫苗效果等问题。附图说明附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为收获鸡胚尿囊液中的绵羊肺炎支原体的菌落形态。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。本发明所采用的技术方案如下：(1)鸡胚准备：准备7-8日龄的健康spf鸡胚，鸡胚活力旺盛、血管清晰，孵化箱培养(温度37.0-37.5℃，湿度50％)。(2)绵羊肺炎支原体接种液准备：复苏绵羊肺炎支原体菌株，37℃温箱培养并传代，生理盐水离心洗涤培养菌液，等体积生理盐水重悬，获得绵羊肺炎支原体接种液。(3)鸡胚接种、培养与收获：将绵羊肺炎支原体接种液接种7-8日龄的健康spf鸡胚，经卵黄囊接种，每枚鸡胚接种0.2ml，接种后，孵化箱继续培养5d，培养条件为温度37.0～37.5℃，湿度50％。无菌收获死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液。测定活菌滴度，若活菌滴度满足需求，则获得绵羊肺炎支原体无血清抗原。(4)若活菌滴度无法满足需求，则需要再进行以下步骤来提高活菌滴度：用生理盐水稀释鸡胚尿囊液，得到鸡胚尿囊液10-1稀释液，对鸡胚尿囊液10-1稀释液继续接种7-8日龄的健康spf鸡胚传代1次，无菌收获接种后死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液；然后再次用生理盐水10-1稀释鸡胚尿囊液，得到稀释液，将稀释液经尿囊腔接种健康spf鸡胚并收获接种后死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液；或将稀释液经卵黄囊接种健康spf鸡胚，无菌收获接种后死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液，测定活菌滴度，获得绵羊肺炎支原体无血清抗原。实施例1一种无血清绵羊肺炎支原体抗原的制备方法如下：(1)鸡胚准备：准备7日龄的健康spf鸡胚(spf种蛋购自山东昊泰实验动物繁育有限公司)，鸡胚活力旺盛，血管清晰，孵化箱培养(温度37.0-37.5℃，湿度50％)。(2)绵羊肺炎支原体接种液准备：复苏绵羊肺炎支原体y98株(购自中国兽医微生物菌种保藏中心cvcc，编号cvcc384)，37℃温箱培养1天，传代培养，8000rpm离心15min，生理盐水离心洗涤培养菌液后用等体积生理盐水重悬，获得绵羊肺炎支原体接种液。(3)鸡胚接种、培养与收获：将绵羊肺炎支原体接种液接种7日龄的健康spf鸡胚，经卵黄囊接种，每枚鸡胚接种0.2ml，接种后，孵化箱继续培养5d。无菌收获死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液。测定活菌滴度，获得绵羊肺炎支原体无血清抗原。结果：收获鸡胚尿囊液中绵羊肺炎支原体抗原活菌滴度高达109ccu/ml，平均活菌滴度为4.0×108ccu/ml。实施例2一种无血清绵羊肺炎支原体抗原的制备方法如下：(1)鸡胚准备：准备7日龄的健康spf鸡胚(spf种蛋购自山东昊泰实验动物繁育有限公司)，鸡胚活力旺盛，血管清晰，孵化箱培养(温度37.0-37.5℃，湿度50％)。(2)绵羊肺炎支原体接种液准备：复苏绵羊肺炎支原体y98株(购自中国兽医微生物菌种保藏中心cvcc，编号cvcc384)，37℃温箱培养1天，传代培养，8000rpm离心15min，生理盐水离心洗涤培养菌液后用等体积生理盐水重悬，获得接种液。(3)鸡胚接种、培养与收获：绵羊肺炎支原体接种液接种7日龄的健康spf鸡胚，经卵黄囊接种，每枚鸡胚接种0.2ml，接种后，孵化箱继续培养5d。无菌收获死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液。(4)测定活菌滴度，若活菌滴度无法满足需求，则继续进行以下步骤来提高活菌滴度：用生理盐水稀释鸡胚尿囊液，得到鸡胚尿囊液10-1稀释液，将以上获得的鸡胚尿囊液10-1稀释液继续接种7日龄的健康spf鸡胚传代1次，无菌收获接种后死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液；(5)用生理盐水稀释鸡胚尿囊液，得到鸡胚尿囊液10-1稀释液，将10-1稀释的尿囊液经尿囊腔接种鸡胚并收获接种后死亡鸡胚尿囊液及5d后仍未死亡鸡胚尿囊液；测定活菌滴度，获得绵羊肺炎支原体无血清抗原。收获鸡胚尿囊液中含有绵羊肺炎支原体抗原，菌落形态见图1。最高活菌滴度可高达109ccu/ml，平均活菌滴度为3.4×108ccu/ml(表2)。图1为收获鸡胚尿囊液中的绵羊肺炎支原体的菌落形态。表1对比试验例绵羊肺炎支原体y98株在本发明方法和常规含20％血清绵羊肺炎支原体培养基(改良km2培养基)培养，比较结果见表2。表2培养方法/培养基血清含量活菌滴度ccu/ml实施例10％4.0×108实施例20％3.4×108改良km2培养基20％1.0×107如表2所示，本发明方法获得的绵羊肺炎支原体抗原活菌滴度是常规含20％血清绵羊肺炎支原体培养基(改良km2培养基)活菌滴度的34-40倍，明显高于含常规含20％血清改良km2培养基。结果表明，本发明方法具有不含血清、活菌滴度高优点。改良km2培养基(20％血清)的配方为：mem5g，葡萄糖0.4g，丙酮酸钠0.2g，水解乳蛋白5.1g，1％酚红2.5ml，25％新鲜酵母浸出液20ml，青霉素(20万iu/ml)1ml，10％醋酸铊1ml，无菌马血清200ml，混合，用去离子水定容至1000ml，用灭菌的1mnaoh调ph值到7.4。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12