抗MPO蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗mpo蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术：

髓过氧化物酶(myeloperoxidase，mp0)是一种由中性粒白细胞、巨噬细胞、单核细胞分泌的相对分子量为133～155kd，等电点为1.0的高阳离子糖蛋白。mpo由骨髓内进行合成并贮存于粒细胞嗜苯胺蓝颗粒(嗜天青颗粒)中而进入循环，在正常生理情况下，是中性粒细胞和单核细胞氧依赖性杀菌系统的重要组分，属于人体先天免疫系统的一部分，通过把h202和cl-变为次氯酸破坏外来物质，然而在某些特殊条件下，由它催化反应而产生的一系列氧化物质((hocl、3一氯化酪氨酸、酪氨酰基、硝基酪氨酸等)生成过多，当其超过局部抗氧化剂的防御反应时，就会引起氧化应激以及氧化性组织损伤。

mpo，主要由髓系细胞合成。编码人体的mpo基因在17号染色体(q23一q24)，基因片段长度约14×103bp，共有内含子11个，外显子12个。mpo是血红素过氧化物酶超家族之一。mpo是一个大小约150kd二聚体的糖蛋白，这个二聚体由两个亚单位聚合而成，每个亚单位均由一条cc链(重链，约59kd)和一条β链(轻链，约13.5kd)构成，两个亚单位通过α链处的二硫键连接成为成熟的mpo，最终在多形核中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils，pmns)中储存、激活后并且释放。

mpo是中性粒细胞的功能标志和激活标志，其水平及活性变化代表着pmns的功能和活性状态。在炎症反应中，mpo起着双重作用一抗炎和促炎。在机体正常状况下，mpo作为固有免疫系统的一部分，可通过一系列催化反应生成氧化性产物，如次氯酸(hclo)、亚硝酸盐、过氧根等，这些物质能与病原菌蛋白质、dna等发生快速结合反应，破坏其蛋白质结构，以抗击细菌、真菌等病原微生物，进而参与机体的防御等过程。在人体内，mpo组成了mpo—h202一卤素系统，其中mpo反应产物hclo在这系统中作用较明显，它既是氧化物，又是抗菌物。当机体氧化性产物超出一定限度，不仅达不到有效清除活性氧和氧化剂，且会使组织发生氧化应激及氧化性损伤，可导致多种疾病发生，如心血管疾病、肿瘤等。

在心脏、肾和皮肤等疾病的研究中，证实mpo活性是评价中性粒细胞在组织中浸润程度的可靠指标。可在多种疾病中检出，如原发性或继发性血管炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、原发性硬化性胆管炎、系统性红斑狼疮等。另外抗体滴度与疾病活动性相关，可用于早期诊断、疗效判断，复发估计的指标，对临床治疗有重要的参考。在正常淋巴组织中和各种髓样细胞增生症中，mpo均有较强的表达，而不表达于红细胞样前体、淋巴样细胞、原核细胞、肥大细胞、浆细胞以及各种上皮源性肿瘤和肉瘤等。主要用于髓样细胞肿瘤和淋巴样细胞肿瘤的鉴别诊断。

技术实现要素：

发明人提供了一种抗mpo蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是seqidno.2和seqidno.3所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是seqidno.4和seqidno.5所示的核苷酸序列所编码。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别mpo蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别中seqidno.1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为cgmccno.19684的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系12f3a4c11，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2020年04月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述抗mpo蛋白为小鼠igg2a亚型单克隆抗体。

进一步地，所述抗mpo蛋白单克隆抗体以重组蛋白为免疫原进行制备所述重组蛋白包含具有抗原性的mpo片段以及组氨酸蛋白标签，所述mpo片段为人mpo蛋白的第49位至第745位氨基酸片段。。

发明人还提供了一株分泌抗mpo蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系12f3a4c11，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年4月24日，保藏号为：cgmccno.19684。

发明人还提供上述任一所述的抗mpo蛋白单克隆抗体，在mpo蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，上述技术方案选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的mpo第49位至第745位氨基酸区域用于重组表达。6个his的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗mpo蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系12f3a4c11,以及由该细胞系所分泌的抗mpo蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达mpo蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测,可降低误读，提高诊断的准确性。

附图说明

图1：mpo抗原纯化后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2：纯化后mpo单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3：粒细胞肉瘤免疫组化染色结果图(左为(12f3a4c11)的mpo，右为市售mpo兔多抗)。

具体实施方式

实施例1重组mpo蛋白片段的制备

一、基因克隆

从uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号p05164的mpo蛋白序列作为标准序列。依据其与dna结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为抗原肽。选定mpo氨基酸序列第49位至第745位序列，其对应的核苷酸序列为seqidno.1。将目的蛋白片段连接于质粒载体petβ2m上(petβ2m载体采购自武汉金开瑞生物工程有限公司，内含β2m蛋白序列及his标签)合成以上mpo重组蛋白质粒。转化至大肠杆菌感受态细胞top10中，挑取平板上的克隆接种扩培，提取质粒dna，进行pcr鉴定。将pcr显示目的基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于进行下一步实验。

β2m为i类主要组织相容性复合物(mhc)的组分，参与抗原肽向免疫系统的呈递，促进抗体的生成。6-his的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。

二、重组蛋白表达纯化

将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞rosetta中，挑取平板上的克隆接种扩培，保菌。接菌液至4ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃，270rpm条件下振荡培养过夜。然后转接至200ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃、270rpm条件下振荡培养8h后,收集菌体。将表达重组蛋白的菌体进行超声波破碎处理。将菌液8000g离心10min，去上清培养基，保留菌体用适量的pbs缓冲液重悬洗涤，菌体中加入镍柱平衡缓冲液进行超声破碎。超声破碎至菌液澄清后，离心，分别收集沉淀及上清。将破碎上清、沉淀以及经诱导表达的菌体进行sds-page电泳，分析重组蛋白的存在位置。

采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。纯化主要步骤参照常州天地人和生物科技有限公司说明书进行。纯化后的目的蛋白进行透析除盐，并用超滤管进行浓缩。最后通过紫外微量分光光度计测定蛋白浓度，通过sds-page电泳检测蛋白纯度，通过elisa检测分析、确定其特异性，结果见表1。图1为mpo抗原纯化后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2：纯化后mpo单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

表1：elisa检测mpo抗原特异性

注：over表示超过仪器的测量范围，即反应很强。

实施例212f3a4c11杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中获得的mpo蛋白稀释至1mg/ml，然后与等体积的完全弗氏佐剂(cfa,sigma公司)混合乳化，对18-20g的balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹部注射免疫，注射剂量为50μg/只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(ifa,sigma公司)乳化，剂量为25μg/只。

第2次加强免疫

后14天以间接elisa(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用pbs溶液混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(atcc)以5:1比例混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1ml预热至37℃的peg(sigma公司)溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与peg充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4ml预热至37℃的无血清dmem(hyclone公司)培养基，随后的2min内再加入10ml预热无血清dmem培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清dmem培养基，定容至50ml，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心(1000rpm，5min)，弃上清，用10-20mlhat(sigma公司)培养基重悬细胞，并用hat培养基稀释至终浓度为0.5×10⁶cells/ml，所有溶液转移至96孔板中，200μl/孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％co2培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加hat培养基，50μl/孔。

三、elisa筛选阳性杂交瘤细胞

当融合细胞直径长至大概为1-2mm时，吸取50-200μl培养液上清进行首次细胞筛选(elisa、ihc-p及其他方法检测)，同时往培养孔中补加hat培养基至200μl。elisa检测该培养液上清，将检测得到阳性结果的培养孔内细胞培养液全部转移至24孔培养板，补加ht培养基，2ml/孔，培养3天。

重复筛选24孔板中各细胞株，剔除不是阳性结果的培养孔细胞，获得阳性结果较好的培养孔细胞。将这些24孔培养板得到的阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至co2培养箱培养11天，待克隆细胞直径为1-2mm时，重复进行细胞筛选。根据检测结果，每个亚克隆细胞株，选取4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养。一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，即为分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株12f3a4c11。将此细胞株转入t-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。

实施例3体外培养法制备单克隆抗体

一、体外培养

获得稳定的杂交瘤细胞系后，主要采用体外培养法获取单抗。

以含10％胎牛血清的dmem完全培养基培养杂交瘤细胞，然后低速离心后收集培养上清，4℃储存备用。

二、单克隆抗体的纯化

用rproteinasepharosefastflow(ge公司)亲和层析柱纯化抗体：①装柱，将购买的proteina填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1mtris溶液，ph7.0)冲洗至平衡；②上样，将经过0.22μm滤膜过滤的腹水加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1m柠檬酸溶液，ph3.0)冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。最后采用sds-page法鉴定抗体纯度(如附图2),纯度达95％以上，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度，浓度达到3.0mg/ml以上。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚型鉴定

将细胞上清稀释成1μg/ml包被酶标板,每孔加100μl，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％tween的pbs(pbs-t)洗板3次，每孔加入200μl封闭液(含2％bsa的pbs-t溶液)，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1ml杂交瘤细胞株培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。用封闭液1：400稀释hrp标记的羊抗鼠(κ,λ，igm，igg1，igg2a，igg2b，igg3，iga)抗体(southernbiotech公司)，每孔分别加入0.1ml，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加100μltmb(湖州英创生物科技有限公司)底物(a、b等体积混合溶液)进行显色,室温反应15min，每孔加入50μl1nhcl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定450nm波长下的od值。结果显示，本发明单克隆抗体为igg2a型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被mpo蛋白，包被浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，pbs-t洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，pbs-t洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/ml)：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。hrp标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。每孔加入100μltmb(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl1.0n盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出od值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台od值”对应的抗体浓度a。利用下列公式计算出亲和常数为5.26×10⁹l×mol^-1。

实施例6组织芯片染色和鉴定

一、组织蜡块制备过程

对样本组织进行he切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％apes丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二、ihc染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，pbs冲洗3×3分钟。滴加3％h2o2孵育10分钟，pbs冲洗3×3分钟。甩去pbs，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，pbs冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，pbs冲洗3×3分钟，甩去pbs，用新鲜配置的dab显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，pbs返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”；

4、样本为阴性，标记为“-”。

三、样本检测结果：

用抗mpo蛋白单克隆抗体(12f3a4c11)和对照抗体-市售抗mpo兔多抗在30例粒细胞肉瘤上进行同步检测，结果如下表所示。

结果显示:抗mpo蛋白单克隆抗体(12f3a4c11)的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净，说明抗mpo蛋白单克隆抗体(12f3a4c11)特异性强。并且在30例粒细胞肉瘤中，使用抗mpo蛋白单克隆抗体(12f3a4c11)的阳性细胞数和阳性强度高于使用对照试剂，说明抗mpo蛋白单克隆抗体(12f3a4c11)的敏感性和亲和力高于市售抗体。

而用抗mpo蛋白单克隆抗体(12f3a4c11)和对照抗体-市售兔多抗，在正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

图3为粒细胞肉瘤免疫组化染色结果图(左为(12f3a4c11)的mpo，右为市售mpo兔多抗)。其中，12f3a4c11的mpo的染色的阳性细胞数和阳性强度明显高于市售mpo兔多抗的染色强度，说明其敏感度更高。

序列表

<110>福州迈新生物技术开发有限公司

<120>抗mpo蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

<130>2020

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>697

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>1

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