邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体及其应用

本发明属于基因工程领域及酶工程领域，具体涉及邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体及其应用。

背景技术：

粘康酸，又称己二烯二酸，是一种不饱和二元羧酸。在有机合成工业中，粘康酸可以作为树脂、医药、食品和农药的基础原料。因为粘康酸有立体定向构型、活性二元羧酸基团和共轭双键，所以粘康酸可以发生很多反应，被认为是一种很有价值的中间体，可用于生产各种化学品。在日常生活中，顺，顺-粘康酸常用于生产尼龙原材料己二酸。但是由于高分子主链具备一定的规整性，尼龙大多数呈现白色半透明外观，透明性不好限制了其在某些方面的使用，通过引入含侧基或环结构的单体，破坏分子链规整性，可得到透明尼龙。因此，开发能够高效催化合成含侧基的顺，顺-粘康酸的邻苯二酚1,2-双加氧酶(cata)具有重要的意义，其中底物含侧基的儿茶酚(如4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚)可从廉价、可再生的生物质资源中获得，从而使得工艺流程具有满足绿色工业的发展需求的潜能。

定点突变作为分子改造的一种有效方式，被广泛应用于改善酶性质以及提高工业酶制剂的催化效率等方面。在前期研究中，已获得的野生型cata(专利申请公布号：cn111254151a)与其他来源的重组邻苯二酚1,2-双加氧酶相比，在4位取代顺，顺-粘康酸的制备中具有一定优势。为了进一步提高cata对底物含侧基的儿茶酚的催化活力，本发明通过定点突变对野生型cata中位于底物口袋周围的氨基酸残基进行分子改造，得到催化效率有所提高的突变体cata^v90a和cata^i206v，提高了cata在制备4位取代顺，顺-粘康酸上的应用潜力。

技术实现要素：

发明目的：针对目前酶法合成4位取代粘康酸的工艺中存在的酶活性低、底物口袋小、产物得率低等问题，本发明提供了一种催化活性较高、底物口袋较大的邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体。

本发明还要解决的技术问题在于提供表达所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的基因及其重组载体和重组表达转化体。

本发明同时还要解决的问题在于提供一种所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的制备方法和所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体在制备4位取代粘康酸中的应用。

为实现上述目的，本发明提出了一种邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体，所述邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体是以野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶序列为基础，将其第90位缬氨酸残基替换为丙氨酸(cata^v90a)或将第206位异亮氨酸残基替换为缬氨酸(cata^i206v)后得到。在野生型cata氨基酸序列的基础上对第90位缬氨酸残基和第206位异亮氨酸残基进行替换后，仍具有邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性，在此基础上获得了底物口袋扩大的突变体，其中，野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶氨基酸序列如seqidno.1所示，其详细信息披露于专利cn111254151a中。

本发明进一步提出了编码权利要求1所述的邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体的基因，其核苷酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示，其氨基酸列如seqidno.4和seqidno.5所示。

进一步地，本发明提出了包含上述基因的重组载体，所述重组表达载体可以通过本领域常规方法将所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体核酸连接于各种表达载体上构建而成，所述表达载体为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，更优选质粒pet28a。所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体核酸可以操作性地连接于所选载体中合适表达的调控序列的下游，以实现所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的组成型或诱导型表达。

较佳的，可以通过下述方法制得本发明所述的重组突变表达载体：利用dna定点突变技术获得含有所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体核酸序列的重组载体pet28a-arcata^v90a，其核酸序列如seqidno.2所示，其氨基酸序列如seqidno.4所示，重组载体pet28a-arcata^i206v其核酸序列如seqidno.3所示，其氨基酸序列如seqidno.5所示。

本发明同时提出了一种重组菌，通过将上述的重组载体转化至宿主微生物中得到。本发明所述的重组表达转化体可以通过本领域常规方法将所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足所述重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体基因可被有效表达即可。优选的，所述重组菌的宿主菌为escherichiacolibl21(de3)。

上述重组菌的构建方法包括如下步骤：将重组突变载体pet28a-arcata^v90a和pet28a-arcata^i206v通过热击法转化至e.colibl21(de3)中，分别得到重组菌e.colibl21(de3)(pet28a-arcata^v90a)和e.colibl21(de3)(pet28a-arcata^i206v)。

本发明进一步提出了上述重组菌在制备邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体中的应用。

本发明所述突变酶通过对所述转化体进行培养后分离得到的。所述培养的方法和条件为本领域常规的方法和条件，可以根据宿主类型和培养方法等因素进行适当的选择，只要所述重组表达转化体能够生长并产生所述突变酶即可。所述培养所用的培养基为本领域任何可使所述转化体生长并产生所述突变酶的培养基，较佳的为lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph7.0，较佳的，所述培养包括如下步骤：

(i)将重组菌活化后得到的种子液接种到培养基中，培养至od600nm为0.6-0.8时，加入iptg，iptg的终浓度为0.05-1.0mm(优选0.1mm)，诱导表达后，离心收集菌泥；

(ii)将上述收集的菌泥用100mmtris-hcl(ph7.5)清洗两遍，然后加入10ml的100mmtris-hcl(ph7.5)重悬，超声破碎，离心得到的上清即为粗酶液。

进一步地，本发明提出了上述重组菌在合成4位取代顺,顺-粘康酸中的应用，所述的4位取代顺,顺-粘康酸优选为4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸。

具体地，包括如下步骤：

(1)将重组菌种子液接种到培养基中，培养至od600nm为0.6-0.8时，加入iptg，iptg的终浓度为0.05-1.0mm，优选0.1mm，诱导表达后，离心收集菌泥；

(2)酶催化：将步骤(1)得到的菌泥进行超声破碎，离心，得到含邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的粗酶液；向tris-hcl缓冲液中添加粗酶液和4位取代儿茶酚，建立酶催化反应体系，进行酶催化反应，生成相应4位取代顺,顺-粘康酸。

其中，步骤(1)中，重组菌活化后得到的种子液的制备方法为将重组菌接种到含有50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，即得。

步骤(1)中，将重组菌种子液按照1％的体积比接种到lb液体培养基中。

步骤(1)中，所述的诱导表达为在20℃，150rpm诱导表达2-10h，优选8h。

步骤(2)中，所述的tris-hcl缓冲液中tris-hcl的浓度为50-100mm；4位取代儿茶酚的终浓度为10-90mm。

步骤(2)中，所述的酶催化反应体系中，粗酶液的终用量为0.1-1u/ml。

优选的，所述的tris-hcl缓冲液中tris-hcl的浓度为100mm；4位取代儿茶酚的浓度为10mm；含突变酶cata^v90a的粗酶液的终用量为0.28u/ml，含突变酶cata^i206v的粗酶液的终用量为0.29u/ml。

其中，所述的4位取代儿茶酚优选为4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚。

步骤(2)中，粗酶液的制备方法具体为将步骤(1)得到的菌泥用100mmtris-hcl清洗后，再重悬于10ml的100mmtris-hcl中，超声破碎后，离心，所得上清液即为粗酶液；其中，每200ml种子液处理后，离心得到的菌泥，重悬于10ml的100mmtris-hcl中。

酶活定义如下：在30℃下每分钟转化1微摩尔底物儿茶酚所需的酶量定义为一个酶活单位u。

步骤(2)中，所述酶催化反应为在ph6.0-10.0，20-45℃反应1-9h；优选的，所述酶催化反应均为在ph7.5，25℃下反应1h。

所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体具高效催化4位取代儿茶酚，制备4位取代顺，顺-粘康酸的性能。相较于其他现有的制备方法，本发明所述的制备方法具有反应条件温和，操作简便，产物收率高等显著优势，符合绿色发展理念，具有很好的工业化前景。

有益效果：本发明提供了两个邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体，并构建得到重组表达邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的重组菌cata^i206v和cata^v90a。cata^i206v催化产4-乙基顺,顺-粘康酸和4-丙基顺，顺-粘康酸分别为1.68g/l和1.58g/l，cata^v90a催化产4-乙基顺，顺-粘康酸和4-丙基顺,顺-粘康酸分别为1.57g/l和1.45g/l。与野生型邻苯二酚1,2-双加氧酶(专利申请公布号：cn111254151a)相比，突变酶cata^i206v以4-乙基儿茶酚为底物时，产率提高了13.5％，以4-丙基儿茶酚为底物时，产率提高了24.4％，突变酶cata^v90a以4-乙基儿茶酚为底物时，产率提高了6.08％，以4-丙基儿茶酚为底物时，产率提高了14.2％。

附图说明

图1为pet28a-arcata转化子质粒电泳验证图，其中泳道m为10,000bpmarker，泳道1-3为转化子质粒pet28a-arcata^i206v，泳道4-6为转化子质粒pet28a-arcata^v90a；

图2为pet28a-arcata转化子质粒双酶切的电泳验证图，其中泳道m为10,000bpmarker，泳道1-3为转化子质粒pet28a-arcata^i206v的双酶切验证，泳道4-6为转化子质粒pet28a-arcata^v90a的双酶切验证；

图3为pet28a-arcata^i206v在不同iptg浓度下诱导表达突变体cata^i206v，破碎细胞上清蛋白电泳结果，其中泳道m为premixedproteinmarker(low)，泳道1为不加iptg诱导的对照cata上清空白对照，泳道2、3、4、5、6、7分别为0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1.0mmiptg浓度下诱导的cata^i206v上清蛋白电泳结果；

图4为pet28a-arcata^v90a在不同iptg浓度下诱导表达突变体cata^v90a，破碎细胞上清蛋白电泳结果，其中泳道m为premixedproteinmarker(low)，泳道1为不加iptg诱导的对照cata上清空白对照，泳道2、3、4、5、6、7分别为0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1.0mmiptg浓度下诱导的cata^v90a上清蛋白电泳结果；

图5为pet28a-arcata^i206v在不同诱导时间下诱导表达cata^i206v，破碎细胞上清蛋白电泳结果，其中泳道m为premixedproteinmarker(low)，泳道1为诱导0h的对照cata上清空白对照，泳道2、3、4、5、6分别为诱导2h、4h、6h、8h、10h的cata^i206v上清蛋白电泳结果；

图6为pet28a-arcata^v90a在不同诱导时间下诱导表达cata^v90a，破碎细胞上清蛋白电泳结果，其中泳道m为premixedproteinmarker(low)，泳道1为诱导0h的对照cata上清空白对照，泳道2、3、4、5、6分别为诱导2h、4h、6h、8h、10h的cata^v90a上清蛋白电泳结果；

图7为野生型cata与突变酶cata^v90a及cata^i206v的反应温度对酶活影响的对比图；

图8为野生型cata与突变酶cata^v90a及cata^i206v的反应ph对酶活影响的对比图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本申请提出了一种邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体，是以野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶序列为基础，将其第90位缬氨酸残基替换为丙氨酸(cata^v90a)或将第206位异亮氨酸残基替换为缬氨酸(cata^i206v)后得到。通过对第90位缬氨酸残基和第206位异亮氨酸残基进行替换后，仍具有邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性，在此基础上获得了底物口袋扩大的突变体。

本发明所述邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体的粗酶酶活力测定是通过测定产物粘康酸的含量来反应其酶活。该酶促反应体系(1ml)及反应条件如下：100mm的tris-hcl(ph7.5)，100μl粗酶液，浓度为10mm的儿茶酚底物，催化条件为ph7.5，25℃恒温反应1h，95℃加热10min灭活，离心，上清液过膜。采用uplc检测产物粘康酸的含量，具体为acquityuplcbehc18色谱柱，150mm×2.1mm流动相：5mm醋酸钠:甲醇＝88:12(ph3.2)；紫外检测器，波长265nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl。

实施例1突变体cata^v90a和cata^i206v的获得。

设计含有突变位点的引物，以含有野生型cata的基因片段的质粒为模板，利用引物对引物1(seqidno.6)和引物2(seqidno.7)、以及引物3(seqidno.8)和引物4(seqidno.9)，分别进行突变体cata^v90a和cata^i206v基因片段的扩增；利用引物对引物5(seqidno.10)和引物6(seqidno.11)进行载体基因片段的扩增。

pcr反应体系及反应条件见表1。

表1目的基因的pcr反应体系及反应条件

其中模板dna为质粒pet28a-arcata，该菌株已公开于中国发明专利cn111254151a中。

pcr反应程序：94℃变性10min；按如下参数循环35次：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s；最后72℃延伸10min。

将pcr产物按1μl/50μl的体系加入dpni消解酶，37℃恒温消解2h后，利用clonexpress^tmⅱ重组反应体系(clonexpressiionestepcloningkit；cat:c112-01/02)进行突变基因片段与载体基因片段的连接，待连接反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min，然后将该连接产物转化e.colibl21(de3)感受态细胞(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，涂布于带有卡那霉素抗性的lb琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆提取质粒并进行转化子质粒验证，利用ndei和ecori酶对转化子质粒进行双酶切验证，得到大小约为889bp和5234bp的两个片段。转化子质粒验证电泳图如图1所示，转化子质粒双酶切验证电泳图如图2所示。经验证后的转化子质粒送至通用生物系统(安徽)有限公司测序，测序结果正确后可获得阳性重组突变载体。结果显示，含有突变体cata^v90a和cata^i206v基因片段的重组载体构建成功。

实施例2诱导剂iptg浓度对突变体cata蛋白表达的影响。

将获得的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。将菌液按照1％的体积比接种到100ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃和200rpm下培养至600nm处的光密度达到0.6-0.8时，以不加iptg诱导作为空白对照，分别加入终浓度为0.05-1.0mm的iptg(选取终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mm的iptg浓度梯度)诱导，20℃，150rpm诱导6h。诱导结束后4℃，8000rpm离心10min收集菌泥，-20℃保存备用。

将上述收集的菌泥用100mmtris-hcl(ph8.0)清洗两遍，然后加入10ml的100mmtris-hcl(ph8.0)重悬，超声破碎(200w，超3s，停7s，共10min)。离心得到的上清即为粗酶液，粗酶液的蛋白电泳结果如图3和图4所示，蛋白大小约为34.9kda。由图3和图4可知，本发明提供的诱导突变体cata^i206v和cata^v90a蛋白表达最适itpg浓度均为0.1mm。

实施例3诱导时间对重组cata蛋白表达的影响。

当菌体密度od600为0.6-0.8时，在对数生长前期加入0.1mm的iptg诱导剂，以不加iptg诱导作为空白对照，分别在20℃下培养2h、4h、6h、8h、10h，菌泥破碎得粗酶液，蛋白电泳结果如图5和图6所示。由图5和图6可知，加入0.1mmiptg诱导剂，诱导后的8h内，蛋白的表达水平一直在增加，当诱导时间达到了10h，蛋白的表达水平有所下降。本发明提供的诱导突变体cata^i206v和cata^v90a蛋白表达最适诱导时间均为8h。

实施例4温度对突变体酶活的影响。

酶促反应体系(1ml)及反应条件如下：100mm的tris-hcl(ph8.0)，100μl粗酶液，浓度为10mm的儿茶酚底物，催化条件为ph8.0，温度分别为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，反应1h，95℃加热10min灭活，离心，上清液过膜。采用uplc检测产物粘康酸的含量，具体为acquityuplcbehc18色谱柱，150mm×2.1mm流动相：5mm醋酸钠:甲醇＝88:12(ph3.2)；紫外检测器，波长265nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl。如图7所示，结果表明，突变体cata^i206v和cata^v90a在反应温度为15℃-25℃时，酶活均在提高，当反应温度为25℃时达最高，较野生型cata分别提高了5.0％和7.8％。当温度大于25℃时，酶活均呈下降趋势。本发明提供的突变体cata^i206v和cata^v90a反应最适温度均为25℃。

实施例5ph对突变体酶活的影响。

采用实施例4中酶促反应体系测定ph对突变体酶活的影响，其中温度为25℃，ph分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，反应结束后，采用实施例4中uplc检测方法测定产物的含量。如图8所示，结果表明，突变体cata^i206v和cata^v90a在ph为6.5-7.5时，酶活均在提高，当ph为7.5时，酶活达到最高，较野生型cata分别提高了7.7％和15.5％，当ph大于7.5时，酶活呈下降趋势。本发明提供的突变体cata^i206v和cata^v90a反应最适ph均为7.5。

实施例6突变体酶促动力学参数的测定。

为了测定酶的动力学参数，将突变酶在ph7.5、25℃下与野生型在ph8.0、30℃下催化4位取代儿茶酚反应1h，反应体系为：100mm的tris-hcl)，100μl粗酶液，分别加入浓度为0.1-10mm的4位取代儿茶酚底物，在以4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚为底物条件下，分别测定反应速度，从而得出酶促反应初速度与底物浓度之间的关系，利用lineweaver-burke作图法计算突变体的酶促反应动力学参数。

结果表明，以4-乙基儿茶酚为底物时，野生型cata、突变体酶cata^v90a和突变体酶cata^i206v的km值分别为835.7μm、516.0μm、412.5μm，其中突变体酶cata^v90a和突变体酶cata^i206v与底物4-乙基儿茶酚的亲和性分别是野生型的1.62倍和2.03倍；kcat/km值分别为13.68s^-1mm^-1、19.65s^-1mm^-1、28.08s^-1mm^-1，其中突变体酶的催化效率分别是野生型的1.44倍和2.05倍。以4-丙基儿茶酚为底物时，野生型cata、突变体酶cata^v90a和突变体酶cata^i206v的km值分别为1123.1μm、705.3μm、463.2μm，其中突变体酶cata^v90a和突变体酶cata^i206v与底物4-乙基儿茶酚的亲和性分别是野生型的1.59倍和2.42倍；kcat/km值分别为11.85s^-1mm^-1、15.50s^-1mm^-1、25.01s^-1mm^-1，其中突变体酶cata^v90a和突变体酶cata^i206v的催化效率分别是野生型的1.31倍和2.11倍。

实施例7突变菌株酶催化合成4位取代粘康酸。

酶催化反应体系(1ml)及反应条件如下：100mm的tris-hcl，实施例三所述的粗酶液100μl，浓度为10mm的底物，催化条件为ph7.5，25℃，反应1h，95℃加热10min灭酶，离心，上清液过膜，采用实施例4中uplc检测方法测定产物的含量。经检测，以cata^i206v催化4位取代儿茶酚，1ml催化体系中4-乙基顺,顺-粘康酸的浓度为1.68g/l，4-丙基顺,顺-粘康酸的浓度为1.58g/l，以cata^v90a催化4位取代儿茶酚，1ml催化体系中4-乙基顺,顺-粘康酸的浓度为1.57g/l，4-丙基顺,顺-粘康酸的浓度为1.44g/l。与野生型邻苯二酚1,2-双加氧酶(专利申请公布号：cn111254151a)相比，突变酶cata^i206v以4-乙基儿茶酚为底物时，产率提高了13.5％，以4-丙基儿茶酚为底物时，产率提高了24.4％；突变酶cata^v90a以4-乙基儿茶酚为底物时，产率提高了6.08％，以4-丙基儿茶酚为底物时，产率提高了13.4％。

对比例1

作为对照，将野生菌cata(专利申请公布号：cn111254151a)诱导破碎获得的粗酶液按照实施例7相同的催化反应体系(其中催化条件为ph8.0，30℃)催化生成4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸，经检测催化液中产物4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸的浓度分别为1.48g/l和1.27g/l。

序列表

<110>南京工业大学

<120>邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体及其应用

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>294

<212>prt

<213>野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶(artificialsequence)

<400>1

metthrgluthrglnvalaspileargasngluasngluglythrala

151015

valglualaglyserlysalathrgluargphethralaserglylys

202530

leusergluleuasnvalprolysgluargvalserleuleualagly

354045

alaleuilelysalaalaasnaspilevalvalgluhisgluvalthr

505560

tyrgluglutyrasnalaleulysalatrpleuilelysvalglythr

65707580

aspglyglutrpproleupheleuaspvaltrpleugluhisthrval

859095

gluaspvalasnserglngluargproglythrlysglythrileglu

100105110

glyprotyrtyrvalproglyserprogluleualathrproalathr

115120125

valleumetargaspglyglugluglythrproleuargphethrgly

130135140

glnphethraspthrasnglyseralaleuglnasnalaglnvalglu

145150155160

iletrphisalaaspalaalaglyphetyrserglntyralaprogly

165170175

leuproglutrpleupheargalathrvallysalaaspaspglngly

180185190

argphegluileasnthrmetargproalaprotyrglnileprothr

195200205

aspglyalacysglyglnleuileglualaalaglytrphisalatrp

210215220

argproalahisilehisilelysvalseralaproglytyrglnpro

225230235240

valthrglnglnleutyrpheproglyaspprohisasnalaaspasp

245250255

ilealaseralavallysprogluleumetleuaspproargproarg

260265270

thraspglyglyalaglyglugluvalvaltyrasntyrileleuala

275280285

lysgluglygluthrlys

290

<210>2

<211>885

<212>dna

<213>邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体核苷酸序列(artificialsequence)

<400>2

atgaccgagacccaagttgacattcgcaatgaaaatgagggcaccgcagtggaagccggt60

agcaaagcaaccgaacgctttaccgccagtggtaaactgagcgagctgaacgtgccgaaa120

gaacgcgtttctttactggctggtgctttaattaaagccgccaacgatatcgtggtggaa180

cacgaagtgacctacgaggagtacaacgctttaaaagcatggctgatcaaagttggcacc240

gacggtgaatggccgctgtttttagatgcttggctggaacataccgtggaggatgtgaac300

agtcaagaacgtccgggcaccaaaggtacaattgagggcccgtactatgttccgggtagc360

ccggagctggcaacacccgctaccgtgctgatgcgcgatggtgaagaaggcacaccgctg420

cgcttcaccggccagtttaccgataccaatggtagcgcactgcagaacgcccaagttgaa480

atttggcacgccgatgccgccggcttttatagtcagtatgcccccggtctgccggaatgg540

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