专利名称:一种蛇床子素的衍生物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机化学领域，具体涉及一种杂环化合物，含五节环，仅有的环杂原子为直接连接在位置1的氧原子，特别是涉及蛇床子素。
背景技术：
蛇床子素又名甲氧基欧芹酚，其化学名为7-甲氧基-8异戊烯基香豆素，是从伞形科植物中提取的一种香豆素类化合物，为无色柱状结晶，分子量244.24，熔点82～84℃，易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂，微溶于水。其结构式为 蛇床子素具有广泛的药理活性，如增强免疫功能、抗骨质疏松、抗病毒、抗突变、植物雌激素样调节、抗诱变、抗肿瘤等功效，因而受到人们的普遍关注。在抗肿瘤活性方面，KawaiiS等发现蛇床子素对肿瘤细胞显示出一定抗增殖作用(Antiproliferative effect ofisopentenylated cournarins on serral cancer cell lines，Anticancer Res，2001，3B)；周俊等通过建立建立BALB/C裸鼠的人肺腺癌和肺鳞癌模型，给予蛇床子素剂量为1.5μg/(g·d)，观察瘤体的大小、重量和动物血清中肺癌标志物DR-70的水平，结果显示蛇床子素对肺鳞癌的抑瘤率为69.7％，对肺腺癌的抑瘤率为50.0％，对DR-70也有显著降低作用(蛇床子素对肺腺癌、肺鳞癌生长抑制作用的实验研究，癌变·畸变·突变，2002年第04期)。沈秀等选择小鼠宫颈癌(U14)、肉瘤(S180)、肝癌(H22)3种瘤株以考察蛇床子素的抗肿瘤活性，并通过对胸腺、脾等多项指标综合考察蛇床子素的高抑瘤活性和低毒性特征，结果显示最佳抑瘤率分别为U1460.0％、S18068.2％、H2262.1％，并且蛇床子素对小鼠的肝、脾指数和胸腺指数几乎无影响(蛇床子素对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用，中华医学实践杂志，2006年第3期)。但蛇床子素水溶性差，几乎不溶于水，限制了蛇床子素的制剂载药量及临床使用范围。
发明内容本发明要解决的技术问题是改进化学结构，以提高蛇床子素的水溶性，使其制剂载药量提高。
本发明解决上述技术问题的技术方案是
一种蛇床子素的衍生物，其特征在于具有由通式(I)表示的结构 其中R为-F、-Cl、-Br、-I、-HSO3、-PO4、-HPO4、-H2PO4其中一种，较佳是-Br、-I、-HSO3、-2HPO4、-H2PO4、-HPO4中的一种，最佳是-Br、-HSO3、-HPO4中的一种。
所述的蛇床子素与R的结合位点可以是(a)当R是-HSO3、-PO4、-HPO4、-H2PO4其中一种时，R可以结合在蛇床子素不饱和内酯环上的α、β位上，如式(1)所示 (b)当R是-HSO3、-PO4、-HPO4、-H2PO4其中一种时，R还可以结合在蛇床子素不饱和内酯环上的α、β位上和异戊烯基的不饱和双键上，如式(2)所示 (c)当R是卤素时，R结合在蛇床子素的异戊烯基的不饱和双键上，如式(3)或(4)所示
本发明所述蛇床子素的衍生物的制备方法，该方法有以下步骤组成(1)将纯度98％以上的蛇床子素溶于70％～100％乙醇中，与等体积1～2倍摩尔浓度的无机酸或相应的盐溶液在80～85℃水浴回流5～10小时，然后回收乙醇至无醇味；或者将纯度98％以上的蛇床子素溶于四氯化碳中，与等量的卤素水溶液混合均匀，70～80℃水浴回流0～4小时，静置1～24小时，然后回收四氯化碳；(2)将步骤1得到的产物冷冻干燥；(3)将步骤2得到的干燥产物用无水乙醇进行结晶。
所述的无机酸或盐是HCl、HBr、HI、NaBr、NaI、H2SO3、NaHSO3、H3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4中的一种，优选HBr、HI、、NaBr、NaI、NaHSO3、Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4中的一种，最好是NaBr、HBr、HI、NaHSO3、Na2HPO4、K2HPO4中的一种。
所述的卤素是F2、Cl2、Br2、I2，优选Cl2、Br2、I2，最佳是Br2。
所述的乙醇浓度最好是95％。
本发明所述的蛇床子素衍生物与蛇床子素相比，在增强免疫功能及抗肿瘤方面本发明具有同样甚至更好的效果，且克服了蛇床子素水溶性差的不足，显著增加了该药物制剂的载药量。
本发明所述的蛇床子衍生物可用于制备防治恶性肿瘤疾病的药物。
本发明所述的蛇床子衍生物与制备各种剂型所需的辅料混合，按照常规的制备方法，可以制备成各种相应的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、冻干粉针、注射液等。
下面将通过效果实验和实施例来证明本发明所具有的优点。
1.实验材料a.蛇床子素衍生物1制备例2所述的亚硫酸氢蛇床子素钠；蛇床子素衍生物2制备例3所述的蛇床子素亚硫酸氢钠加成物；蛇床子素衍生物3制备例8所述的碘代蛇床子素；b.生理盐水购于广州中医药大学第一附属医院，昆明龙津药业有限公司生产，批号20050516；c.参麦注射液购于广州中医药大学第一附属医院，浙江正大青春宝药业有限公司生产，批号20040912；d.醋酸泼尼松购于广州中医药大学第一附属医院，浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号200401022；e.5-FU(5-氟脲嘧啶)购于广州中医药大学第一附属医院，济南明圣制药技术有限公司生产，批号200401126。
2.蛇床子素衍生物的增强免疫作用(一)小鼠炭粒廓清实验取NIH小鼠，体重18～22g，随机分为5组，生理盐水组，蛇床子素衍生物注射组(2.0mg/ml)、蛇床子素衍生物口服组(3.0mg/ml)，参麦注射液组，醋酸泼尼松组。除蛇床子素衍生物口服剂组、醋酸泼尼松组灌胃给药0.2ml/10g体重外，各组均尾静脉注射给药0.1ml/10g体重。每天给药1次，连续给药5天，末次给药后30分钟，尾静脉注射墨汁(0.1ml/只)，于注射后2分钟和12分钟用毛细管(预先用肝素溶液湿润)分别从眼眶静脉丛取血50ul，溶液5ml的0.1％碳酸钠溶液中，摇匀，置于600nm比色，测定光密度(OD)。小鼠脱颈椎处死，分别称取肝、脾重量，计算廓清指数K或校正廓清指数α。
k=logOD1-logOD2t1-t2]]>
OD1、OD2为不同时间所取血样的光密度，t1-t2为取两血样的时间差。结果见表1表1本发明药物对小鼠炭粒廓清的影响
注与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与醋酸泼尼松组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与参麦注射液组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01。
表1结果表明，与空白对照组比较蛇床子素衍生物注射组和口服组1、2、3，参麦注射液组，醋酸泼尼松组，均能显著提高小鼠的吞噬功能(P值均＜0.01)，提示各实验组药物均有明显的提高免疫功能的作用。与醋酸泼尼松组比较蛇床子素衍生物注射剂组和口服剂组1、2、3，及参麦注射液组均有显著性差异(P值均＜0.05)，提示蛇床子素衍生物注射用药、蛇床子素衍生物口服用药、参麦注射液均具有提高免疫功能的作用。与参麦注射组比较蛇床子素衍生物注射组、蛇床子素衍生物口服组均无差异(P＞0.05)，提示蛇床子素衍生物注射用药及口服用药，其提高免疫的作用强度与参麦注射液相当。
(二)体液免疫实验取NIH小鼠，体重18～22g，随机分为5组，生理盐水组，蛇床子素衍生物注射组(2.0mg/ml)、蛇床子素衍生物口服组(3.0mg/ml)，参麦注射液组，醋酸泼尼松组。各组小鼠腹腔注射5％生理盐水鸡红细胞混悬液0.2ml进行免疫，除蛇床子素衍生物口服组、醋酸泼尼松组灌胃给药0.2ml/10g体重外，各组均尾静脉注射给药0.1ml/10g体重，每日给药1次，连续给药7天。末次给药后1小时，各组小鼠眼眶静脉取血，离心，取血清用生理盐水稀释100倍，取稀释血清1ml，与％生理盐水鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml混合，在37℃恒温箱中保温30分钟后，0℃冰箱中中止反应。然后离心，取上清液于在540nm处比色，测定光密度(OD)，另设不加血清的空白对照，取其上清液作为比色时调零。以OD读数作为判定血清溶血素的指标，比较各组的差异。结果见表2。
表2本发明药物对小鼠血清溶血素生成水平的影响
注与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与醋酸泼尼松组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与参麦注射液组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01。
表2结果表明，与空白对照组比较蛇床子素衍生物1、2和3的注射组和口服组，参麦注射液组，醋酸泼尼松组，均能显著增加小鼠的红细胞抗体(P值均＜0.01)，提示各实验组药物均有明显的提高免疫功能的作用。与醋酸泼尼松组比较蛇床子素衍生物1、2和3的注射组和口服组，及参麦注射液组均无显著性差异(P值均＞0.05)，提示蛇床子素衍生物注射用药、蛇床子素衍生物口服用药、参麦注射液均具有较高的免疫功能。与参麦注射组比较蛇床子素衍生物注射组和口服组均无差异(P＞0.05)，提示蛇床子素衍生物注射用药及口服给药，其提高免疫的作用强度与参麦注射液相当。
(三)对小鼠免疫器官重量的影响取NIH小鼠，体重14～18g，随机分为5组，生理盐水组，蛇床子素衍生物注射组(2.0mg/ml)、蛇床子素衍生物口服组(3.0mg/ml)，参麦注射液组，醋酸泼尼松组。除蛇床子素衍生物口服组、醋酸泼尼松组灌胃给药0.2ml/10g体重外，各组均尾静脉注射给药0.1ml/10g体重，每日给药1次，连续给药7天。末次给药后2小时，将各组小鼠全部脱颈椎处死，剖取胸腺、脾脏，把其他组织剥离干净，滤纸吸干水分后，称重。计算胸腺系数和脾脏系数(胸腺系数＝胸腺重/体重×100，脾脏系数＝脾脏重/体重×100)，结果见表3。
表3本发明药物对小鼠免疫器官胸腺、脾脏重量的影响
注与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与醋酸泼尼松组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与参麦注射液组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01。
表3结果表明，与生理盐水对照组比较蛇床子素衍生物1、2、3的注射组和口服组，参麦注射液组，均能显著提高小鼠胸腺系数、脾重系数(P值均＜0.01)，提示各实验组药物均有明显的提高免疫功能的作用。与醋酸泼尼松组比较蛇床子素衍生物注射组和口服组、参麦注射液组均有显著性差异(P值均＜0.01)，提示蛇床子素衍生物和参麦注射液提高免疫功能的作用非常强。与参麦注射液组比较蛇床子素衍生物注射组、蛇床子素衍生物口服组均无差异(P＞0.05)，提示蛇床子素衍生物注射用药及口服给药，其提高免疫的作用强度与参麦注射液相当。
3.蛇床子素衍生物的抗肿瘤作用(1)体外抗肿瘤细胞(HepG2、LOVO、MCF-7、A549、K562、SGC-7901)试验采用RPMI-1640培养液，加15％新生小牛血清(FCS，56℃灭活30min)，用Hepes缓冲液调pH至约7.2，HepG2(人肝癌细胞)、LOVO(人结肠癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、A549(人肺腺癌细胞)、K562(人白血病细胞)、SGC-7901(人胃癌细胞)细胞株分别配成单个细胞悬液，在37℃饱和湿度、5％CO2培养箱中培养，待用。取对数生长期的以上各种细胞分别以0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化后，用上述培养液稀释至浓度4～5×104/ml，接种于96孔板，每孔加入190μl。同时设溶剂对照及空白对照，每个剂量设3个平行孔，常规培养24h后，加入不同剂量的受试药物10μl，在37℃饱和湿度、5％CO2培养箱中培养72h后，每孔加入MTT溶液(用生理盐水配制，0.2μm微孔滤膜滤过)10μl(5mg/ml)，振荡混匀后，培养箱中继续培养4h。弃去上清液，每孔加入150μl二甲基亚砜，微量振荡器振荡，约1h后，用酶标仪在570nm波长处测其OD值，计算抑制率，求IC50，测定时减去空白对照。按下列公式计算细胞毒性细胞毒性＝(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100％。
结果如表4所示，本发明所述蛇床子衍生物对各种瘤细胞均有较高的抑制作用。
表4本发明药物对不同肿瘤细胞株的抑制作用(％)
注与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
(2)体内抗肿瘤作用取接种于昆明小鼠腹腔约7～10天的S180肿瘤细胞腹水，无菌条件下操作，根据细胞浓度加入等量的生理盐水，配制成瘤细胞悬液(最佳细胞数为1～2×107/ml)，接种于同种异体小鼠左后肢液皮下，雄性体重18～22g，雌性17～21g，每次实验均用同一性别，每只小鼠注射0.2ml或灌胃0.3ml/10g。瘤细胞接种第2天，将小鼠称重，并随机分组，10只小鼠一组，开始给试验用药、阴性对照溶剂(ip生理盐水0.2ml/d)、阳性对照药(10mg氟尿嘧啶/Kg小鼠体重)，连续给药10天。至第11天，动物称重，并剖取各组动物的肿瘤，称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实验结果如表5所示，本发明所述的蛇床子素衍生物有较好的抗肿瘤作用。
瘤重抑制率＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％表5本发明药物对S180荷瘤小鼠瘤重及体重的影响(
)
具体实施方式
制备例1蛇床子素与亚硫酸结合生成亚硫酸蛇床子素，其化学反应过程为
所述的亚硫酸蛇床子素的制备方法包括以下步骤1、将高纯度蛇床子素1.12g溶于20ml的95％乙醇中，加入含0.41g亚硫酸的水溶液20ml，80℃回流提取10小时使其至反应完全；2、将反应产物溶液回收乙醇至无醇味后，再进行冷冻干燥；3、将干燥产物用无水乙醇进行结晶，得到白色结晶1.50g，收率98.04％。
制备例2蛇床子素与亚硫酸氢钠结合生成亚硫酸氢蛇床子素钠，其化学反应过程为 所述的亚硫酸氢蛇床子素钠的制备方法包括以下步骤1、将高纯度蛇床子素1.12g溶于20ml的95％乙醇中，加入含0.52g亚硫酸氢钠的水溶液20ml，85℃回流提取5小时使其至反应完全；2、将反应产物溶液回收乙醇至无醇味，冷冻干燥即可；3、将干燥产物用无水乙醇重结晶，得到白色粉末1.60g，收率97.56％。
制备例3蛇床子素与亚硫酸氢钠结合生成蛇床子素亚硫酸氢钠加成物，其化学反应过程为
所述的蛇床子素亚硫酸氢钠加成物的制备方法包括以下步骤1、将高纯度蛇床子素1.12g溶于20ml的95％乙醇中，加入含1.04g亚硫酸氢钠的水溶液20ml，82℃回流提取7小时使其至反应完全；2、将反应产物溶液回收乙醇至无醇味，冷冻干燥即可；3、将干燥产物用无水乙醇重结晶，得到白色粉末2.08g，收率96.30％。
制备例4蛇床子素与氢溴酸结合生成溴代蛇床子素，其化学反应过程为 所述的溴代蛇床子素的制备方法包括以下步骤1、将高纯度蛇床子素1.12g溶于20ml的四氯化碳中，缓缓滴加含0.18g氢溴酸的四氯化碳溶液20ml，边滴加边振摇，静置1小时使其至反应完全；2、将反应产物溶液回收四氯化碳即得。
3、产物干燥得白色粉末1.26g，收率96.92％。
制备例5蛇床子素与溴化钠结合生成溴代蛇床子素，其化学反应过程为
所述的溴代蛇床子素的制备方法包括以下步骤1、将高纯度蛇床子素1.12g溶于20ml的95％乙醇中，加入含0.29g溴化钠的水溶液20ml，85℃回流提取8小时使其至反应完全；2、将反应产物溶液回收乙醇至无醇味后，再进行冷冻干燥；3、将干燥产物用无水乙醇进行结晶，得白色结晶1.43g，收率95.97％。
制备例6蛇床子素与碘化氢结合生成碘化蛇床子素，其化学反应过程为 本发明所述的碘化蛇床子素的制备方法包括以下步骤1、将高纯度蛇床子素1.12g溶于20ml的四氯化碳中，缓缓滴加含0.27g碘化氢的四氯化碳溶液20ml，边滴加边振摇，静置24小时使其至反应完全；2、将反应产物溶液回收四氯化碳即得。
3、将干燥产物用无水乙醇进行结晶，得到白色结晶1.33g，收率95.68％。
制备例7蛇床子素与碘化钠结合生成碘化蛇床子素，其化学反应过程为 本发明所述的碘化蛇床子素的制备方法包括以下步骤1、将高纯度蛇床子素1.12g溶于20ml的95％乙醇中，加入含0.38g碘化钠的水溶液20ml，80℃水浴回流10小时；2、将反应产物溶液回收乙醇至无醇味后，再进行冷冻干燥；3、将干燥产物用无水乙醇进行结晶，得到白色结晶1.45g，收率96.67％。
制备例8
蛇床子素与碘结合生成碘代蛇床子素，其化学反应过程为 所述的碘代蛇床子素的制备方法包括以下步骤1、将高纯度蛇床子素1.12g溶于20ml的四氯化碳中，缓缓滴加含2.54g碘的四氯化碳溶液20ml，边滴加边振摇，70～80℃回流提取4小时后，静置10小时使其至反应完全；2、将反应产物溶液回收四氯化碳即得；3、产物干燥得到白色粉末3.48g，收率95.08％。
制备例9蛇床子素与磷酸氢二钠结合生成蛇床子素磷酸氢二钠加成物，其化学反应过程为 所述的蛇床子素磷酸氢二钠加成物的制备方法包括以下步骤1、将高纯度蛇床子素1.12g溶于20ml的95％乙醇中，加入含1.43g磷酸氢二钠的水溶液20ml，85℃回流提取10小时使其至反应完全；2、将反应产物溶液回收乙醇至无醇味，冷冻干燥即可；3、将干燥产物用无水乙醇重结晶，得到白色粉末2.39g，收率93.72％。
制备例10蛇床子素与磷酸氢二钠结合生成蛇床子素磷酸氢二钠加成物，其化学反应过程为
所述的蛇床子素磷酸氢二钠加成物的制备方法包括以下步骤1、将高纯度蛇床子素1.12g溶于20ml的95％乙醇中，加入含2.86g亚硫酸氢钠的水溶液20ml，80℃回流提取5小时使其至反应完全；2、将反应产物溶液回收乙醇至无醇味，冷冻干燥即可；3、将干燥产物用无水乙醇重结晶，得到白色粉末3.88g，收率97.00％。
应用例1(片剂)1、活性药物制备例1所述蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物2、辅料淀粉、微晶纤维、滑石粉、微粉硅胶、硬脂酸镁等3、处方蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物70g、淀粉3.0g、微晶纤维12.5g、滑石粉1.5g、微粉硅胶2.0g、硬脂酸镁1.0g4、制备方法将主、辅药混合，过五号筛，混匀，压片，共制成1000片，每片含蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物30mg。
应用例2(胶囊剂)1、活性药物制备例1所述蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物2、辅料淀粉、糊精等3、处方蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物70g、淀粉100g、糊精25g4、制备方法将主、辅药混合，过筛，混匀，用50％乙醇适量制粒，过七号筛，于60～70℃烘干，装胶囊，共制成1000粒，每粒含蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物70mg。
应用例3(颗粒剂)1、活性药物制备例1所述蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物2、辅料糖粉、糊精等3、处方蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物1g、糖粉3000g、糊精1000g4、制备方法将主、辅药混合，过筛，混匀，用50％乙醇适量制粒，于60～80℃烘干，整粒，用12～14目筛除去大颗粒，然后用60目筛除去细粉，使颗粒均匀，密封，共制成1000袋，每袋含蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物1mg。
应用例4(口服液)1、活性药物制备例1所述蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物2、辅料纯净水
3、处方蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物100g、纯净水10000ml。
4、制备方法将主药溶于纯净水中，搅匀，滤过，灌装，每支10ml，每支含蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物100mg。
应用例5(注射剂)1、活性药物制备例1所述蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物2、辅料注射用水3、处方蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物30g、注射用水10000ml。
4、制备方法将主药溶于注射用水中，搅匀，滤过，灌装，每瓶10ml，冷冻干燥，压盖密封，每瓶含蛇床子素亚硫酸氢钠衍生物30mg。
权利要求
1.一种蛇床子素的衍生物，其特征在于具有由通式(I)表示的结构 其中R为-F、-Cl、-Br、-I、-SO3、-PO4、-HPO4、-H2PO4其中一种。
2.根据权利要求
1所述的蛇床子素的衍生物，其特征在于R是-Br、-I、-HSO3、-2HPO4、-H2PO4、-HPO4中的一种。
3.根据权利要求
1所述的蛇床子素的衍生物，其特征在于R是-Br、-HSO3、-HPO4中的一种。
4.权利要求
1、2或3所述的蛇床子素的衍生物的制备方法，该方法有以下步骤组成(1)将纯度98％以上的蛇床子素溶于70％～100％乙醇中，与等体积1～2倍摩尔浓度的无机酸或相应的盐溶液在80～85℃水浴回流5～10小时，然后回收乙醇至无醇味；或者将纯度98％以上的蛇床子素溶于四氯化碳中，与等量的卤素水溶液混合均匀，70～80℃水浴回流0～4小时，静置1～24小时，然后回收四氯化碳；(2)将步骤(1)得到的产物冷冻干燥；(3)将步骤(2)得到的干燥产物用无水乙醇进行结晶。
5.根据权利要求
4所述的蛇床子素的衍生物的制备方法，其特征在于所述的乙醇浓度是95％。
6.根据权利要求
4所述的蛇床子素的衍生物的制备方法，其特征在于所述的无机酸是HCl、HBr、HI、H2SO3、H3PO4中的一种。
7.根据权利要求
4所述的蛇床子素的衍生物的制备方法，其特征在于所述的无机酸盐是NaBr、NaI、NaHSO3、Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4中的一种。
8.根据权利要求
4所述的蛇床子素的衍生物的制备方法，其特征在于所述的卤素是F2、Cl2、Br2、I2中的一种。
9.权利要求
1或2所述的蛇床子素的衍生物在制备防治恶性肿瘤疾病的药物中的应用。
专利摘要
本发明公开了一种蛇床子素衍生物，该衍生物可用以下通式表示其中R为－F、－Cl、－Br、－I、－HSO
文档编号A61P35/00GK1995029SQ200610124214
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月14日
发明者赖小平, 黄松, 蒋东旭, 赵爱国, 黄鸣清, 谢友良 申请人:广州中医药大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan