，抽取质粒后送公司测序。
[0054] 3. 2pSUM0融合蛋白的诱导表达
[0055] 1.测序正确的质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)涂板，挑取转化平板上的单克隆接种 于含30 μ g/ml Kan的3ml LB培养液的试管中，37°C 200rpm振摇过夜；
[0056] 2.次日按1 :100接种于30 μ g/ml Kan的50ml LB培养液中，37°C 200rpm振摇至 菌体 0D600 为 0. 6 (约 2. 5h);
[0057] 3.取出200 μ 1培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用20 μ I 2X上样缓冲液 (0· 5Μ NaCl，20mM Tris, 20mM 咪唑）重悬菌体沉淀；
[0058] 4.向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0. 2mmol/l，25°C 220rpm振摇6h，诱导 SUMO融合蛋白表达；
[0059] 5.取出200 μ 1培养物，12000g室温离心3min，弃上清，用20 μ I 2X上样缓冲液 重悬菌体沉淀，剩余培养物4°C 5000g离心20min，弃上清，置-80°C冻存。
[0060] 3. 3SUM0融合蛋白的纯化
[0061] Ni-NTA-Sepharose CL-6B亲和层析柱及配套缓冲液购自Sepharose公司。
[0062] 1.将 SOOmT,诱导表达的菌液沉淀用 20ml Ni-NTA Binding-Buffer (20mM Tris，500mM NaCl, and 20mM imidazole, pH 8.0)重悬后，超声破碎（功率200W，工作4sec， 间歇 8sec，共 20min)，4°C 12000g 离心 20min，取上清；
[0063] 2.用 Ni-NTA Binding-Buffer 预平衡的 Ni-NTA-Sepharose CL-6B 亲和层析柱，上 清液以〇. 6ml/min流速上样至亲和层析柱；
[0064] 3.用 Ni-NTA Binding-Buffer 以 I. Oml/min 流速冲洗，至流出液 0D280 值到达基 线；
[0065] 4.用 Ni-NTA Wash ing-Buffer (20mM Tr i s，500mM NaCl，and 50mM imidazole, pH7. 0)以I. Oml/min流速冲洗，至流出液0D280值到达基线；
[0066] 5.用 Ni-NTA Elution-Buffer (20mM Tris，500mM NaCl, and 250mM imidazole, ρΗ7· 0)以L Oml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；得到pSUMO-proteinl融 合蛋白。
[0067] 3. 4融合蛋白切割及目的蛋白纯化
[0068] 将pSUMO-proteinl融合蛋白装入透析袋中，于PBS(pH7.0)中透析过夜；根据 SUMO酶（GeneCopoeia，美国）酶切手册对pSUMO-proteinl融合蛋白进行酶切，具体条件如 下：测pSUMO-proteinl融合蛋白浓度，按50ug融合蛋白加入IU SUMO酶，30°C酶切60min。 由于SUMO标签和融合蛋白SUMO上含有6个组氨酸蛋白标签（这些His标签是pSUMO质粒 本身就含有的），所以继续利用Ni 2+-NTA亲和层析以去除SUMO标签或没有被切割的SUMO融 合蛋白，具体如下：
[0069] L用PBS (ρΗ7· 0)预平衡的Ni-NTA-S印harose CL-6B亲和层析柱），酶切后的样 品混合液以0. 6ml/min流速上样至Ni-NTA，收集流出液；
[0070] 2.用Elution-Buffer (20mM Tris, 500mM NaCl, and 250mM imidazole, pH 7. 0)以 0. 6ml/min流速冲洗，收集洗脱液。
[0071] 3.对酶切后的洗脱液进行Tricine/SDS-PAGE电泳分析。
[0072] 结果见图2。结果显示，经SUMO酶酶切和柱纯化后可以得到高纯度的重组免疫调 节肽 Caseinlll0
[0073] 4、收集重组免疫调节肽Caseinlll。
[0074] 3. 5重组免疫调节肽的活性分析
[0075] 采用FluoroBeads? T淋巴细胞分离试剂（ONE LAMBDA, US)分离人血液T淋巴细 胞，1^]\0 1640(含10%?03，10011/1111口611；[。;[11;[11/81:代口1:01115^;[11)培养液调整细胞浓度至 约4X IO6个/ml。依次加入重组免疫调节肽，重组免疫调节肽Caseinlll的终浓度分别为 5和10 μ g/ml，以加 PBS为空白对照。为了进一步检测重组多肽活性，在37°C、5% C02浓度 条件下培养4?后每孔加入用2. 5 μ g/ml的PI (碘化丙啶）进行单染后检测细胞存活与死 亡情况。所用的仪器为 FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)，用 CellQuest 软件进行分析。流式细胞实验结果显示该重组免疫调节肽具有很强的促进人T淋巴细胞增 殖的活性。
[0076] 结果见图3。
[0077] 结果显示，与PBS对照组（48. 02% )相比，重组免疫调节多肽处理后T淋巴细胞增 殖能力显著增强（82. 31 %和78. 50% )。
【主权项】
1. 一种免疫调节肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 表达权利要求1所述免疫调节肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. 权利要求1所述多肽的扩增引物，其特征在于上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
4. 权利要求1所述免疫调节肽的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤： a. 构建权利要求1所述多肽的表达载体pSUMO ; b. pSUMO融合蛋白的诱导表达； c. pSUMO融合蛋白的纯化、收集； d. 重组抗菌肽的纯化、收集。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： a. 构建权利要求1所述多肽的表达载体pSUMO : 人工合成该多肽核酸序列，利用权利要求3所述的上下游引物通过PCR技术扩增出含 有BsaI、HindIII酶切位点的该多肽核酸片段进行胶回收，回收产物双酶切后载入pSUMO载 体； b. pSUMO融合蛋白的诱导表达： 1) 测序正确的质粒转入大肠杆菌，接种于含卡那霉素的LB培养液培养； 2) 收集菌体，重悬后加入IPTG诱导pSUMO融合蛋白表达； c. pSUMO融合蛋白的纯化： 诱导表达后的菌液沉淀用Ni-NTA Binding-Buffer重悬后，超声破碎，离心，取上清，上 清液上样至Ni-NTA亲和层析柱，洗脱pSUMO融合蛋白，收集洗脱液，SDS-PAGE电泳分析； d. 重组抗菌肽的纯化、收集： 采用SUMO酶对pSUMO融合蛋白进行酶切，利用Ni-NTA-S印harose CL-6B亲和层析柱 去除SUMO标签或没有被切割的SUMO融合蛋白，洗脱重组抗菌肽，电泳分析，收集重组抗菌 肽。
6. 权利要求1所述的免疫调节肽在制备促T淋巴细胞增殖的药物中的应用。
7. 权利要求1所述的免疫调节肽在制备奶制品添加剂中的应用。
【专利摘要】本发明属于医药及生物工程领域，公开了一种免疫调节肽及其制备方法和应用。该免疫调节肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该免疫调节肽具有很强的促T淋巴细胞增殖作用，能够用于制备促T淋巴细胞增殖的药物。
【IPC分类】A61K38-17, C12N15-12, A23C9-152, A61P37-04, C12N15-11, C12N15-70, C07K14-47
【公开号】CN104530212
【申请号】CN201410821244
【发明人】郭锡熔, 季晨博, 崔县伟, 尤梁惠, 史春梅
【申请人】南京市妇幼保健院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月25日