SacI 双酶切获得的大片段连 接，构建中间载体，T-Pcrg7-gfp-Ttrpc，T-P/?ar7-gfp-Ttrpc。其扩增引物序列如下： 3)
【主权项】
1. 农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，其特征在于：该转化子菌株的农杆菌感染受体 为英白黑粉菌（Ustilago esculenta)。
2. 根据权利要求1所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，其特征在于：农杆菌采 用农杆菌菌株AGL-I，农杆菌菌株GV3101或农杆菌菌株EHA105。
3. 根据权利要求2所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，其特征在于：农杆菌的 基因表达载体采用植物PCAMBIA1301表达载体，并用来自构巢曲霉gpda启动子和hsp70启 动子中的一种或两种替换植物表达载体中的35S启动子；或者，农杆菌的基因表达载体以 PPK2载体为骨架，通过Infusion的同源重组方法插入各种目的片段构建所需表达载体。
4. 根据权利要求3所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，其特征在于：植物 PCAMBIA1301表达载体插入适用于真菌系统的sGFP报告基因或新霉素磷酸转移酶II位点。
5. -种制备权利要求1所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，其特征 在于该方法包括以下的步骤： 1) 制备真菌表达载体； 2) 农杆菌感受态的制备； 3) 电转化农杆菌； 4) 农杆菌介导的转化获得所述的转化子。
6. 根据权利要求4所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，其特征在于 步骤1)包括以下的步骤： ① 将gpdA和hsp70启动子序列从现有其它基因载体中PCR扩增出来，在5'加上BstXI 位点，在3'加上ApaI位点，克隆至T载体； ② 将pCambial301载体上含AatII的片段PCR扩增出来，在5'加上ApaI位点，在3' 加上其他合适的T载体上有的酶切位点，然后克隆至T载体或直接酶切； ③ 将含有启动子的T载体用ApaI和KpnI酶切，将含有AatII片段的PCR产物或T载 体用ApaI和KpnI酶切，将这两者连接，得到含有启动子和AatII片段的质粒；用BstXI和 AatII将启动子和AatII片段切出，连接至用BstXI和AatII酶切过的pCambial301载体； ④ 接着要将多克隆位点的EcoRI和SacI位点之间插入真菌Hsp70启动子片段或gpda 启动子片段，在HindIII和PstI位点之间插入真菌的终止子trpc片段；在启动子hsp70和 pgpda的5'端加上EcoRI酶切位点，在3'端加上SacI酶切位点；在终止子Ttrpc的5'端 加上PstI酶切位点，Ttrpc的3'端加上HindIII酶切位点；将phsp70和pgpda启动子，两 端酶切位点EcoRI与SacI，扩增连接到pmdl9-T simple载体后用EcoRI与SacI双酶切，与 第一目标中的载体EcoRI与SacI双酶切片段连接后转化；新得到载体多克隆位点加入了真 菌启动子，将gpda启动子和hsp70启动子中的一种或两种，两端酶切位点HindIII与PstI， 扩增连接到pmdl9-T simple载体后用HindIII与PstI双酶切，与多克隆位点已经插入启 动子的载体HindIII与PstI双酶切后的片段连接后，最终转化得到包含真菌启动子并包含 潮霉素抗性位点的真菌表达载体。
7. 根据权利要求4所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，其特征在于 步骤2)包括以下的步骤： ① 将-80°C保存的甘油菌株在LB平板上划线，在28°C下过夜培养活化； ② 挑选平板上的单克隆，转入5ml的LB管中摇菌过夜； ③ 转移5ml小摇菌液至IOOml LB的摇菌瓶中，28°C下250rpm振荡培养4-5小时，定 时测定菌液OD600值，培养2小时后每30min测定一次，当0D600值达到0. 3-0. 4时，从摇 床中取出摇瓶，置于冰上充分冷却； ④ ）菌液转到预冷的50ml离心管中，4°C 4000g以下离心15分钟；小心地倒掉上清，用 20ml预冷的无菌水洗涤重悬菌体，此步骤有时可以重复一次； ⑤ 4°C 4000g以下离心20分钟后，用IOml预冷的10%甘油重悬浮菌体； ⑥ 4°C 4000g以下离心20分钟后，用2-3ml预冷的10%甘油重悬浮菌体； ⑦ 按100 μ 1等份装入预冷的I. 5ml离心管中，于-80°C保存。
8. 根据权利要求4所述的根据权利要求1所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的 制备方法，其特征在于步骤3)包括以下的步骤： ① 于-80°C冰箱中取出电转化感受态细胞IOOul，冰浴化冻； ② 取2ul纯化好的载体质粒，载体质粒浓度为lOpg/ul，加入感受态细胞，冰浴5min，转 入预冷的电极杯中，2500V电击； ③ 加入500ul的LB培养基在28°C摇床中200rpm恢复培养2小时； ④ 4000g以下离心5分钟，在超净台内将离心管中500ul上清去掉，剩余菌液用枪头吹 打均匀，涂在LB平板上，LB平板含有50mg/L Rif以及50-100mg/L待筛选的抗生素； ⑤ 28°C培养箱放置2天，挑选单克隆菌落PCR验证； ⑥ 经鉴定后含有目标质粒的农杆菌加20%甘油保存于-80°C。
9. 根据权利要求4所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，其特征在于 步骤4)包括以下的步骤： ① 将-80°C保存的甘油菌株在LB，LB平板含有50mg/LRif和50-200mg/L目标载体的 抗生素，平板上划线，在28°C下过夜培养活化； ② 挑单克隆在5ml的LB培养基，LB培养基含有50mg/LRif和50-100mg/L目标载体的 抗生素，摇菌； ③ 离心收集菌体，转入頂培养基中培养6小时至0D6000. 5，頂培养基中加 AS至 200uM ； ④ 同时取从-80°c保存的黑粉菌甘油菌株在Yro培养基上划线活化，挑选单克隆在5ml 的液体Yro培养基上培养3天，转入新的Yro培养基中摇至0D6000. 5备用； ⑤ 以共培养基制备固体平板，其上放置一张混合纤维素膜，将农杆菌0D600稀释到 0. 2,取IOOul的黑粉菌和IOOul的农杆菌混合均匀涂布于纤维素膜上，25°C培养2天； ⑥ 将混合纤维素膜取出放于筛选培养基YPD上，培养基YPD中含有50-200ug/ml hyg 或G418加200ug/ml特美汀，28°C培养3-5天，挑选生长的菌落做后续验证，验证其是否为 转化子。
10. 权利要求1~4任一权利要求所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株用于茭白育 种的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种生物育种领域，尤其涉及一种农杆菌介导茭白黑粉菌（<i>Ustilago？esculenta</i>）转化子菌株及其制备方法和应用。农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，该转化子菌株的农杆菌感染受体为茭白黑粉菌（<i>Ustilago？esculenta</i>）。上述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的一种制备方法，步骤如下：1）制备真菌表达载体；2）农杆菌感受态的制备；3）电转化农杆菌；4）农杆菌介导的转化获得所述的转化子。本发明不需要制备复杂的原生质体，受体来源简单，真菌的孢子、菌丝都可以直接用于转化；转化效率高；另外，得到的转化子单拷贝比率也比较大，有利于获得标记基因。
【IPC分类】C12N15-66, C12Q1-68, C12R1-645, C12N1-15, C12N15-80, C12Q1-04
【公开号】CN104560742
【申请号】CN201510018757
【发明人】彭华正, 韩凝, 金群英, 边红武, 朱汤军, 钱佳
【申请人】浙江省林业科学研究院, 韩凝
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月14日