一种葡萄糖耐受的纤维寡糖酶的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及来源于哈氏嗜纤维菌（Cytophaga hutchinsonii)的一种葡萄糖耐受 的纤维寡糖酶的应用，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 纤维素是由D-葡萄糖残基通过0 -1，4糖苷键连接形成纤维素链，纤维素链又通 过氢键缔合形成不溶于水的纤维素束。纤维素作为植物通过光合作用形成的主要生物质， 是植物细胞壁的主要组成成分，成为地球上最丰富的可再生资源。在当今资源能源日益枯 竭的社会中，充分利用这些生物质资源，将其转化成为人类可以利用的能源和各种化工产 品等，对于人类社会的可持续发展具有重要意义。
[0003]由于其高度有序的晶体结构，纤维素很不容易被降解。在自然环境中纤 维素主要被微生物产生的纤维素酶降解。微生物产生的纤维素酶主要包括纤维素 内切酶（endo-glucannase)，纤维素外切酶（exo-glucanase)以及0 -葡萄糖苷酶 (后-glucosidase)。其中纤维素内切酶包括典型的内切酶和进行性内切酶，可以攻击非结 晶区的纤维素链，产生较短的糖链，并为外切酶提供更多的攻击位点，进行性内切酶在打开 非结晶区的0-1，4糖苷键后可以持续作用于糖链产生纤维寡糖或者纤维二糖。纤维素外 切酶包括纤维二糖水解酶和纤维寡糖酶，可以持续作用于纤维素链产生纤维二糖或是葡萄 糖。0 _葡萄糖苷酶则可以水解纤维二糖水解酶的产物，纤维二糖，为底物产生葡萄糖进而 被微生物代谢利用。有的微生物则能产生纤维寡糖酶（cellodextrinase)，水解纤维寡糖生 成葡萄糖。
[0004] 真菌产生纤维素酶多为胞外酶，具有比较容易分离纯化等特点，现在工业用纤维 素酶多为真菌纤维素酶。而细菌纤维素酶更容易在现在已经比较成熟的大肠杆菌表达系统 中进行异源表达以及纯化，具有很大的应用空间，因而对于高效细菌纤维素酶的发掘显得 尤为重要。
[0005] e-葡萄糖苷酶和纤维寡糖酶可以将纤维寡糖转化成葡萄糖，是纤维素彻底降解 的重要环节，但是其活性受到其产物葡萄糖的反馈抑制，因此难以大量积累葡萄糖，在工业 应用中受到很大限制，寻找具有葡萄糖耐受特性的葡萄糖苷酶和纤维寡糖酶具有重要 实际意义。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种葡萄糖耐受的纤维寡糖酶的应用。
[0007] 一种葡萄糖耐受的纤维寡糖酶CHU_2268在降解纤维素中的应用，所述葡萄糖耐 受的纤维寡糖酶CHU_2268的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
[0008] 优选的，上述葡萄糖耐受的纤维寡糖酶CHU_2268降解纤维寡糖和纤维二糖。
[0009] 葡萄糖耐受的纤维寡糖酶CHU_2268为一个GH3家族的糖苷水解酶，可以降解纤维 寡糖和纤维二糖，终产物都为葡萄糖，在葡萄糖浓度较高的环境中也可以表现出相对较高 的活力，该酶可以和纤维素内切酶共同作用将纤维素转化为葡萄糖。
[0010] 有益效果
[0011] 本发明所述葡萄糖耐受的纤维寡糖酶CHU_2268比较容易在大肠杆菌E. coli中实 现异源表达，获得具有纤维寡糖酶活性的蛋白，有效地解决了哈氏菌生长周期长，酶成分比 较复杂，产量较低，不容易分离纯化的问题。该酶可以降解包括纤维二糖在内的纤维寡糖产 生葡萄糖，而且具有较高的葡萄糖耐受性，在生物能源等工业中具有比较大的应用潜力。
【附图说明】
[0012] 图1、葡萄糖耐受的纤维寡糖酶CHU_2268SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0013] 其中：泳道1、诱导工程菌后超声破碎得到的粗蛋白；泳道2、纯化后的纯化后的纤 维寡糖酶CHU_2268 ;泳道M、marker，分子量为图中所示，单位为KD ;
[0014] 图2、以pNPG为底物的纤维寡糖酶CHU_2268的最适反应曲线图；
[0015] 其中：a、最适反应温度曲线，b、最适反应pH曲线；
[0016] 图3、纤维寡糖酶CHU_2268降解pNPG以及pNPC产物的电泳图；
[0017] 其中：泳道M、marker，所用标准品如图示；泳道1、纤维寡糖酶CHU_2268降解pNPG 产物；泳道2、pNPG与灭活纤维寡糖酶CHU_2268共同孵育的pNPG对照；泳道3、纤维寡糖 酶CHU_2268降解pNPC产物；泳道4、pNPC与灭活纤维寡糖酶CHU_2268共同孵育的pNPC对 昭.
[0018] 图4、纤维寡糖酶CHU_2268降解纤维二糖以及纤维寡糖产物的电泳图；
[0019] 其中：泳道M、marker，所用标准品如图示；泳道1，3, 5, 7分别为纤维寡糖酶 CHU_2268降解纤维二糖（G2)，纤维三糖（G3)，纤维四糖（G4)以及纤维五糖（G5)的产物； 泳道2, 4, 6, 8分别为相应寡糖与灭活纤维寡糖酶CHU_2268共同孵育的G2, G3, G4以及G5 的对照；
[0020] 图5、纤维寡糖酶CHU_2268对葡萄糖的耐受性的酶活曲线；
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明所述的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不 限于此。
[0022] 哈氏嗜纤维菌购自美国菌种保藏中心，菌种编号为ATCC 33406,该菌株非本申请 所保藏菌株。
[0023] 实施例1 :葡萄糖耐受纤维寡糖酶的克隆表达
[0024] 1、哈氏嗜纤维菌的培养
[0025]哈氏嗜纤维菌的培养条件为PY6培养基，30°C，160rpm振荡培养。PY6培养基每升 组分如下：葡萄糖4g，胰蛋白胨6g，酵母提取物0. 5g，水定容至1L，pH 7. 0。
[0026] 2、基因组的提取
[0027] 将培养好的哈氏嗜纤维菌（Cytophaga hutchinsonii)的细菌培养物离心 (10,000Xg，3min)收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司生产的细菌基因 组DNA提取试剂盒），按照产品说明书提取基因组DNA，备用。
[0028]3、目的基因克隆
[0029] (1)引物设计
[0030] 哈氏嗜纤维菌的全基因组测序已经完成，我们选择预测为GH3家族的一个0-葡 萄糖苷酶的基因chu_2268作为研宄对象。
[0031] 基因序列编码758个氨基酸，其编码的糖苷水解酶前体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示，通过SignalP4.1软件分析，预测蛋白N端的18个氨基酸疏水性较强，发明人 预测这一段氨基酸序列是信号肽，去除掉这一部分疏水序列得到糖苷水解酶的成熟蛋白， 其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，对应编码这个糖苷水解酶成熟蛋白的基因序列如SEQ IDNO. 3 所示。
[0032]根据该基因的序列特点，以及序列对应表达蛋白的彳目号狀序列和成熟蛋白序列特 点，发明人设计了两端带有限制性内切酶酶切位点的引物：
[0033] 上游引物:ACGAACGGATCCTCTTGTGAGAAAAAAACAGT，划线部分为BamH I酶切位点。
[0034] 下游引物:CGGACGGTCGACTTACTCATTAAAATATATTTC，划线部分为Sal I酶切位点。
[0035] 委托华大基因公司合成这一对引物用于克隆该糖苷水解酶成熟蛋白基因（该基 因编码的纤维寡糖酶成熟蛋白的氨基酸序列），克隆基因采取PCR扩增的方法。
[0036] (2)目的基因的PCR扩增和纯化
[0037] 在50 u 1 TransStart FastPfu DNA Polymerase反应体系中（购自Transegene 公司，配制方法