析发现，SEQ ID NO:1与米曲霉的蛋白酶氨基酸序列相似性最高，为83%，是一个新的等位基因。
[0030]实施例2里氏木霉reesei)工程菌株的构建
将实施例1中回收的扩增产物连接到PMD18-T载体，获得克隆载体pT-Pro质粒，然后用NcoI和KpnI进行双酶切，回收TR片段；取2 μ I回收产物与NcoI和KpnI双酶切pKDN_5载体连接过夜导入大肠杆菌DH5 α，获得重组表达质粒pKDN-Pro。
[0031]将里氏木霉菌丝体接种于PDA平板，生长4天；切取直径约3 cm的菌落置于约YEG (0.5%酵母粉、1%葡萄糖)液体培养基中，30°C、200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20 ml裂解酶液(Sigma L1412)酶解2_3小时；取出酶解液，加入0.7 M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10min ;弃上清，加 10-20 ml STC 液(20% 蔗糖，50mM Tris-Cl, 50mM CaCl2)悬浮，3000 rpm，离心10 min ;加适量STC悬浮分装(150 μ?/管，18个/ml )。
[0032]取2Pg pKDN- Pro DNA加入到150μ1原生质体中，接着加入500μ1 25%PEG轻轻混匀，室温静置25 min ;然后分2_3次再加Iml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55°C的上层半固体培养基(0.l%MgS04, 1%KH2P04,0.6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖，18.3%山梨醇，0.35%琼脂糖)，轻轻混匀后倒入含10Pg/ml潮霉素下层基础培养基平板(2%葡萄糖，0.5% (NH4) 2S04, 1.5%KH2P04, 0.06%MgS04,0.06%CaCl2，1.5%琼脂)，28°C黑暗培养数天至转化子长出。将其中一株阳性转化子命名为里氏木霉(Trichoderma reesei ) Pro-1。
[0033]实施例3发酵及酶学性质测定
将里氏木霉Pro-1接种于丽发酵培养基(1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH4)2SO4j0.09%MgS04, 2%KH2P04,0.04%CaCl2，0.018% 吐温-80，0.018% 微量元素，0.018%聚丙二醇-2000)培养，28°C培养48小时，然后25°C培养48小时；所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000 g条件下离心10 min,收集上清液；将上清液在浓度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳检测，在38kDa左右处出现一条蛋白带，分子量与预测一致，即为重组表达的蛋白酶。
[0034]蛋白酶酶活测定方法如下:
运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括:福林使用溶液(一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀)，碳酸钠溶液(42.4 8/1)，三氯乙酸(65.4 g/L)，梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液(10.0 g/L)。反应过程如下:试管中加入Iml酶液，40°C温浴2min，加入酪蛋白溶液Iml，摇匀后40°C温浴lOmin，加入2ml三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出静止lOmin，慢速定性滤纸过滤。取Iml滤液，加碳酸钠溶液5ml，加福林试剂使用溶液lml，40°C显色20min，于680nm波长，用1mm比色皿测定吸光度。
[0035]蛋白酶活力单位的定义为Ig固体酶粉(或I ml液体酶)，在一定温度和pH值条件下，Imin水解酪蛋白产生I μ g酪氨酸，即为I个酶活力单位。
[0036]采用上述检测方法对本发明里氏木霉工程菌发酵液上清进行酶活检测，结果显示，发酵液酶活高达5000U/mL，说明本发明构建的工程菌能高效分泌表达米曲霉的蛋白酶。
[0037](I)最适pH分析
用 PH值分别为 3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0 的缓冲液，在温度 50°C条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线，结果如图1所示，本发明所述蛋白酶的最适pH为7.0，为一中性蛋白酶，且在pH50-8.0时能保持60%以上的酶活性。
[0038](2)最适温度分析
分别在 30oC>35oC>40oC>45oC>50oC>55oC>60oC,65oC>70oC>75oC>80oC>85oC>90°C,pH7.0的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，本发明所述中性蛋白酶的最适温度为65°C，在55-70°C时能保持85%以上的酶活性。
[0039]实施例4中性蛋白酶在制备胶原多肽中的应用
本发明利用上述中性蛋白酶处理猪皮，制备得到胶原多肽，产量高，污染小。
[0040]具体工艺过程如下:
1)猪皮的前处理
清洗新鲜猪皮，去除污物后将猪皮表面的油脂刮除；加入适量的水，加热至100°c，保持5min;取出煮熟的猪皮，稍凉后用刀将其表面的脂肪刮去，拔掉猪毛；然后切成1mmX 1mm大小的猪皮块脱脂；
2)皂化法脱脂
脱脂剂为Na2CO3，温度40°C，时间40 min，冰箱冷冻保存备用；
3)酶解制备胶原多肽工艺
将前处理过的猪皮加入去离子水，调PH值为7.0-7.5，加入1%-2%本发明所述中性蛋白酶，恒定温度水解lh，沸水浴10 min灭酶，离心弃去沉淀物。
[0041]采用甲醛滴定法测定上述猪皮中胶原蛋白的水解率约为68%，可见本发明所述中性蛋白酶可广泛用于胶原多肽的生产。
【主权项】
1.一种里氏木霉，其携带有表达中性蛋白酶的重组载体。
2.如权利要求1所述里氏木霉，其特征在于，所述中性蛋白酶为 Ca)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶； (b)在(a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有中性蛋白酶活性的酶。
3.如权利要求2所述里氏木霉，其特征在于，所述中性蛋白酶的编码核苷酸序列为SEQID NO: 2。
4.权利要求1所述里氏木霉的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种里氏木霉工程菌，能高效重组表达中性蛋白酶，发酵酶活达到5000U/mL。所述工程菌重组表达的中性蛋白酶最适pH为7.0，且在pH50-8.0时能保持85%以上的酶活性；最适温度为65℃，且在55-70℃时能保持85%以上的酶活性。所述中性蛋白酶可广泛应用于食品和皮革加工领域。
【IPC分类】C12N1-15, C12R1-885, C12N15-57, C12N9-62
【公开号】CN104711200
【申请号】CN201310681169
【发明人】李佩佩, 王华明, 黄亦钧
【申请人】青岛蔚蓝生物集团有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月12日