n，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离屯、管，即得核 蛋白；
[0化9] 10)胞质蛋白和核蛋白，分装并保存于-80°C，避免反复冻融。提取的蛋白可用 于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验（gelshiftassay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。
[0060] 3、分离与hCLP46启动子区相互作用的蛋白
[0061] 在PSQ96板化iotage)中预先加入30y1d地20 ;
[0062] lOOuLPCR产物中加入50化核蛋白或胞质蛋白，37°C解育15分钟；
[006引 Str巧tavidinSe地arose?HP(Amersham)混匀，取 6yL加入到 46yLbinding bufferAiotage)，W吸头混匀5分钟，混合物加入到含有PCR产物-蛋白混合物的96孔PCR反应板；
[0064] 在Vacuumprepworkstation(biotage)中，四个样品板中依次加入180ml高纯 7jC、Denaturationbuffer、washingbuffer化iotage)和PBS;
[00(55]打开vacuumprepworkstation的累，将vacuumpreptool在高纯水中清洗 30秒.
[0066] 将vacuumpr巧tool移到PCR板中，抓取亲和素包被磁珠-生物素-DM-蛋白 质；
[0067] 将vacuumpreptool在Dena1:urationbuffer、washingbuffer或PBS中洗漆 15 秒.
[0068] 关掉累，将vacuum pr巧tool放入含有d地20的PSQ 96板中，摇动，释放混合物；
[0069] 吸取混合物，放入离屯、管中，-20°C保存。
[0070] 4、SDS-PAGE
[0071]1)按照分子克隆指南配置10%SDS，30%Aa:Bis，IX电泳缓冲液（pH8. 3)，10% 过硫酸锭，2XSDS电泳上样缓冲液，考马斯亮兰染色液、脱色液、12%的分离胶和4%的积 层胶；
[0072] 2)将样品加入等量的2XSDS上样缓冲液，100 °C加热3-5min，12000Xg离屯、 20min，取上清用于SDS-PAGE分析；
[007引如取20y1处理后的样品加入样品池中，并加入5y1标准蛋白Marker作对照；
[0074] 4)电泳：在电泳槽中加入1X电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳 时，积层胶电压80V，分离胶电压140V，电泳至漠酪兰行至电泳槽下端停止（约需化r);
[0075] 5)染色：将胶从玻璃板中取出，切除浓缩胶，考马斯亮兰染色液染色，室温摇床 1-2虹；
[0076] 6)脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。
[0077] 7)利用凝胶成像仪对脱色好的凝胶拍照保存并分析。
[007引用生物标记的引物扩增启动子区DNA片段，PCR产物分别与核蛋白和胞质蛋 白共解育，然后加入与生物素结合的StreptavidinSe地arose?HP，WVacuumprep workstation吸取蛋白质-DM-生物素-StreptavidinSe地arose?HP复合物，W denaturationbuffer、washingbuffer或PBS洗漆后释放到 96 孔板。样本在 12 % 的 SDS-PAGE上电泳，结果（见图1)显示经washingbuffer和PBS洗漆的样本在14.OkD处有 一条显著的条带。
[0079] 5、凝胶阻滞实验
[0080] PCR产物，与核蛋白共解育的DNA-蛋白质复合物，与胞浆蛋白共解育的DNA-蛋白 质复合物，与核蛋白解育的磁珠-生物素-DNA-蛋白质（washingbuffer清洗），与胞浆 蛋白解育的磁珠-生物素-DNA-蛋白质（washingbuffer清洗），分别与适量的Loading BufferCTakaRa)混合后，在1 %琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳完毕后用凝胶成像仪摄像和 分析。
[OOW] 结果（见图2)显示未经洗漆纯化的DM-核蛋白或胞质蛋白中有在大于500bp处 有模糊的DNA染色，而洗漆纯化后的片段则有单一的条带，其迁移速度都显著低于单纯的 蛋白质。SDS-PAGE后分离捕获的蛋白质片断，采用质谱（M巧方法对目的多肤进行检测，确 定该蛋白是组蛋白2A家族的H2A.A蛋白。
[0082] 6、多肤质量指纹图谱鉴定
[0083] SDS-PAGE后分离捕获的蛋白质片断，采用质谱（M巧方法对目的多肤进行检测。通 过对不同长度和位置PCR片段所结合的蛋白质的鉴定，可W对DNA上蛋白质结合位点进行 定位。譬如片段1 (2201-2300)上结合某蛋白质（Proteinl)，若使用片段2(2221-2300)则 不结合Proteinl，则DNA(2201-2220)是Proteinl在DNA上的结合位点。
[0084] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，该对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的该些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种分离DNA结合蛋白并精确定位其DNA结合位点的方法，其特征在于，分离DNA结 合蛋白：通过利用带有生物素标记的引物PCR扩增待研宄DNA片段，先后加入核蛋白或胞 质蛋白和亲和素包被的磁珠，共同孵育，洗去非特异结合的蛋白，加入SDS使蛋白质变性释 放，鉴定蛋白质；定位蛋白质的DNA结合位点：以待研宄的DNA片段为模板，采用不同的引 物通过PCR反应获得相互重叠的DNA片断，根据相互重叠的DNA片断对结合蛋白亲和力的 差异定位结合蛋白的DNA结合位点。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤： 51 :DNA片段的扩增： 以待研宄的DNA片段为模板，利用带有生物素标记的引物通过PCR反应进行扩增； 52 :蛋白质的分离： PCR产物中加入核蛋白或胞质蛋白，共同孵育； 加入亲和素包被的磁珠，共同孵育； 缓冲液洗去非特异结合的蛋白； 加入SDS使蛋白质变性释放，鉴定蛋白质； 53 :定位蛋白质的DNA结合位点： 以待研宄的DNA片段为模板，采用不同的引物通过PCR反应获得相互重叠的DNA片断； 根据上述相互重叠的DNA片断对结合蛋白亲和力的差异定位结合蛋白的DNA结合位 点。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待研宄的DNA片段为200-300bp。
4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤SI中任意一条引物的5'末 端采用生物素标记。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S2具体为： 1) 在96孔板中预先加入30yL高纯水； 2) 100yLPCR产物中加入50yL核蛋白或胞质蛋白，37°C孵育15分钟； 3)StreptavidinSepharose?HP(链霉亲和素琼脂糖凝胶）混勾，取6yL加入到46yL bindingbuffer(结和缓冲液），以吸头混匀5分钟，混合物加入到含有PCR产物-蛋白混 合物的96孔PCR反应板； 4) 在Vacuumprepworkstation(真空准备工作站）中，四个样品板中依次加入180ml 高纯水、Denaturationbuffer(变性缓冲液）、washingbuffer(清洗缓冲液）和PBS(磷 酸缓冲液）； 5) 打开vacuumprepworkstation(真空准备工作站）的抽气泵，将vacuumprep tool(真空准备工具）在高纯水中清洗30秒； 6) 将vacuumpreptool(真空准备工具）移到PCR板中，抓取亲和素包被磁珠-生物 素-DNA-蛋白质复合物； 7) 将vacuumpreptool(真空准备工具）在Denaturationbuffer(变性缓冲液）、 washingbuffer(清洗缓冲液）或PBS(磷酸缓冲液）中洗绦15秒； 8) 关掉抽气泵，将vacuumpreptool(真空准备工具）放入含有超纯水的96孔板中， 摇动，释放混合物； 9) 吸取混合物，放入离心管中，-20 °C保存； 10)DNA结合蛋白的鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，DNA结合蛋白通过SDS-PAGE、凝胶阻滞实 验室或色谱法鉴定。
【专利摘要】本发明提供了一种分离DNA结合蛋白并精确定位其DNA结合位点的方法，分离DNA结合蛋白：通过利用带有生物素标记的引物PCR扩增待研究DNA片段，先后加入核蛋白或胞质蛋白和亲和素包被的磁珠，共同孵育，洗去非特异结合的蛋白，加入SDS使蛋白质变性释放，鉴定蛋白质；定位蛋白质的DNA结合位点：以待研究的DNA片段为模板，采用不同的引物通过PCR反应获得相互重叠的DNA片断；根据上述相互重叠的DNA片断对分离蛋白质亲和力的差异定位分离蛋白质的DNA结合位点。
【IPC分类】C07K1-14, C12Q1-68
【公开号】CN104725465
【申请号】CN201510147863
【发明人】王友信, 王嵬
【申请人】首都医科大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月31日