4min;94°C变性30s，54°C退火30s， 72°C延伸lmin，30 个循环；72°C延长lOmin。
[0047] 3.序方法
[0048] DNA测序采用双脱氧终止法。
[0049] 4.序列分析
[0化日]采用ClustalW2. 1对分离菌株的ITS1-5. 8S-ITS2序列进行多序列比对分析，将完 全一致的序列所代表的菌株归为一类。然后利用BLASTN2. 2. 29+程序捜索核算数据库， 下载得分高、序列一致性达到95%W上的序列，采用ClustalW2. 1进行多序列比对分析， 用MEGA6. 06软件采用N-J法重建系统发育树。数据分析采用最大组合似然模型（Maximum CompositeLikelihood),采取 1000 次bootstrap检验（LarkinMA2007;TamuraK, 2013; 化en化ang, 2000 ;Aleksan化Morgulis, 2008)。
[0化1] 分离得到的酵母菌株ITSl-5. 8S-ITS2序列经过多序列比对分析，308株酵母菌株 共分为27类群。
[0化2] 5.用MEGA6. 06软件采用N-J法重建系统发育树，采用最大组合似然模型将27 个类群酵母菌的代表菌株进行系统发育分析。28号菌株与下载的膜釀毕赤酵母（Pichia membranifaciens)标准序列在同一个进化枝，确定为膜釀毕赤酵母。165、152号菌株确定 为克鲁维毕赤酵母克鲁维变种（Pichiakluyverivar.kluyveri)。5号菌株确定为异常毕 赤酵母。
[0化3] 8和47号菌株与下载的Myerozymacaribbica标准菌株序列在同一个进化枝， 确定为Myerozymacaribbica。186、233、193、245、259、178、236、211、237 号菌株虽然与Myerozymacaribbica标准菌株序列分成了两个进化枝，但是，编号Myerozymacaribbica strainAUMC7262 (2)的菌株与编号IVteyerozymacaribbicastrainAUMC7262 的菌株为同 一株菌，二者的序列分属于strainAUMC7262ITSl-5. 8S-ITS2区核酸序列的一部分。可 W判断 186、233、193、245、259、178、236、211、237 号菌株与Myerozymacaribbicastrain AUMC7262(2)菌株为同种，进而可W认为 186、233、193、245、259、178、236、211、237 号菌株 为Myerozymacaribbica。将 8、47、186、233、193、245、259、178、236、211、237 号菌株确定为 Myerozymacaribbica。
[0054] 菌株 325、350、278、141、9、13-2、242、207、243 被判定为奥莫柯达酵母化odamaea ohmeri)。菌株325、350、278、141、9、13-2和菌株242、207、243分为两个进化枝，该种情况 可能是存在着生理小种的差异。
[0055] 菌株65为德己利酵母值ebaryomycessp.)，菌株351为东方伊萨酵母 (Issatchenkiaorientalis)，菌株 136 为美极梅奇酵母（Metschrdkowiapulcherrima)，菌 株356为葡萄有抱汉逊酵母（Hanseniasporauvarum)。
[0化6] -般认为，ITS区序列进化速率较快，其基因序列和长度存在显著的种间差异， 因此，ITS常常用来作为属或种W下的分类学指标炬eekSV，2003)。序列的相似性超 过99%W上，可W认为已经鉴定到种的水平（LEESB，1992)。通过聚类、选取代表菌株 进行ITS1-5. 8S-ITS2区域序列系统发育分析的方法，将308株酵母归于8个属，分别是 假丝酵母（Candida),包括枯假丝酵母（Candidaquercitrusa) (54株）、福山假丝酵母 (Candidafukuyamaensis) (2株）；有抱汉逊酵母（Hanseniaspora),经鉴定为葡萄酒有抱 汉逊酵母（化nseniasporauvarum) (3株）；德己利酵母值ebaryomyces) (3株）；毕赤酵 母（Pichia),分别为克鲁维毕赤酵母克鲁维变种（Pichiakluyverivar.kluyveri) (20 株）、异常毕赤酵母（Pichiaanomala) (69 株）、膜釀毕赤酵母（Pichiamembranifaciens) (18株）；伊萨酵母（Issatchenkia)，经鉴定为东方伊萨酵母（Issatchenkiaorientalis) (1株）；柯达酵母化odamaea)，经鉴定为奥莫柯达酵母化odamaeaohmeri) (47株）；梅奇 酵母（Metschn;Lkowia)，经鉴定为美极梅奇酵母（Metschn;Lkowiapulcherrima)(l株）； IVteyerozyma，经鉴定为Meyerozymacar;ribica(90 株），具体见表 1 所不。
[0057] 表1不同菌株的类别 [005引
【主权项】
1. 一种酵母菌株，其特征在于，2014年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 号为CCTCCNO:M2014330,保藏名称为MeyerozymacaribbicaGZUMc6。
2. 权利要求1所述的酵母菌株的培养方法，其特征在于，所述酵母菌株的发酵培养基 的碳源为葡萄糖，氮源为牛肉膏和酵母膏的混合物，微量元素为FeSOJPMnS04。
3. 根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述牛肉膏和酵母膏的质量比为 1:0. 9-1. 1〇
4. 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下成分：按 重量百分数计，葡萄糖1. 9% -2. 1%，牛肉膏和酵母膏1. 4% -1. 6%，FeSO4O. 10-0.llg/L， MnSO4O. 06-0. 07g/L。
5. 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下成分：按重 量百分数计，葡萄糖1. 5%，牛肉膏和酵母膏2. 5%，FeSO4O.llg/L，MnSO4O. 07g/L。
6. 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下成分：按重 量百分数计，葡萄糖2. 5%，牛肉膏和酵母膏1. 5%，FeSO4O.llg/L，MnSO4O. 06g/L。
7. 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下成分：按重 量百分数计，葡萄糖2%，牛肉膏和酵母膏1. 5%，FeSO4O.llg/L，MnSO4O. 06g/L。
8. 根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述酵母菌株的发酵条件为：摇床转 速为175-185rpm，培养温度为24-26°C，发酵培养基的pH为6. 4-6. 6,发酵培养基的菌体终 浓度为 4. 8X106-5. 2X106cfu/ml。
9. 根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述酵母菌株的发酵条件为：摇床 转速为180rpm，培养温度为25°C，发酵培养基的pH为6. 5,发酵培养基的菌体终浓度为 5X106cfu/ml〇
10. 权利要求1所述的酵母菌株在增香发酵中的应用。
【专利摘要】本发明涉及酵母菌领域，特别涉及一种酵母菌株、其培养方法以及应用。一种酵母菌株，2014年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2014330，保藏名称为Meyerozyma caribbica GZUMc6。本发明提供的酵母菌株，菌落形态为圆形、近圆形，边缘锯齿状，菌落干燥，表面粗糙，杏白色，具有浓郁的香蕉香味。本发明通过对酵母菌株的培养基成分碳源、氮源以及微量元素进行筛选，得到的培养基能很好的满足酵母菌株生长的需求。本发明提供的酵母菌株在酵素、酱油、醋、果酒等发酵中均取得了很好的增香效果，得到的发酵物风味独特，对发酵物风味物质的形成起到非常重要的作用。CCTCC NO:M 201433020140709
【IPC分类】C12J1-00, C12G3-06, A23L1-238, C12N1-16, C12G1-022, C12R1-645
【公开号】CN104774775
【申请号】CN201510069311
【发明人】周礼红, 侯素媛
【申请人】周礼红
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年2月10日