转移酶基 因FWT-01的重组菌株，优选所述菌株为P.pastorisGS115,优选为重组菌株P.pastoris GS115/FWT-01。
[0015] 对于E.coli表达系统，本发明采用E.coli表达系统载体，如祀T-22b(+)。将果糖 基转移酶基因插入E.coli表达载体，获得重组载体。将获得的重组载体，转化E.coli表达 系统，如E.coli化21 0E3)，获得可表达果糖基转移酶的E.coli重组表达菌株。本发明中 优选质粒为祀T-22b(+)，优选表达宿主为E.coliBL21 〇)E3)。
[0016] 对于S.cerevisiae表达系统，本发明采用S.cerevisiae表达系统载体，如 PYX212。将果糖基转移酶基因插入S.cerevisiae表达载体，获得重组载体。通过电转化方 法，将重组质粒转化S.cerevisiae表达系统，如S.cerevisiaeW303-1A，获得果糖基转移 酶S.cerevisiae表达菌株。本发明中优选质粒为pYX212,优选表达宿主为S.cerevisiae W303-1A。
[0017] 本发明还提供了一种制备果糖基转移酶FWT01的方法，包括W下步骤：
[0018] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株。
[0019] 2)培养重组菌株，诱导（如果是诱导型启动子）、过量表达重组果糖基转移酶。
[0020] 3)回收并纯化所表达的果糖基转移酶FWT01。
[0021] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有优良性质的、 可高效催化庶糖生产高纯度低聚果糖的果糖基转移酶、及其氨基酸序列、基因序列。
【附图说明】
[0022] 图1为果糖基转移酶在P.pastorisGS115中的异源表达。
[0023] 图2为温度对果糖基转移酶酶活力与稳定性影响曲线。
[0024] 图3为抑对果糖基转移酶酶活力与稳定性影响曲线。
【具体实施方式】
[00巧]实施例1 ;果糖基转移酶在P.pastorisGS115中的异源表达
[0026] 实验过程中，采用转入PPIC9K空质粒的P.pastorisGS115转化子作为对照株。 将6株筛选获得的高拷贝数转化子分别接种25血BMGY培养基（250血摇瓶），30°C，220rpm 摇瓶培养2化。进一步将其转接25血BMMY培养基（250血摇瓶），30°C，220巧m摇瓶诱导 培养12化，其中每2化补加250yL甲醇。如图1所示，果糖基转移酶高拷贝数阳性转化子 P.pastoris03的胞外果糖基转移酶酶活力最高，可达117.抓/mL。
[0027] 实施例2;果糖基转移酶在S.cerevisiaeW303-1A中的异源表达
[0028] 将阳性S.cerevisiae重组子接种YTO培养基，30°C发酵56h。随着发酵的逐步进 行，果糖基转移酶的产量逐渐增加，当发酵至4她时，酶活达到最大，为19.8U/mL。同时，随 着发酵的不断进行，重组S.cerevisiae的菌体浓度也逐渐增加。当发酵至4她时，菌体浓 度达到最大，〇〇日。。=3.2。
[0029] 实施例3;温度对果糖基转移酶酶活力与稳定性的影响
[0030] 酶最适温度测定时的条件为：温度范围为30~70°C、底物为庶糖、lOOmM磯酸-巧 樣酸缓冲液（pH5.5)。在不同温度下测定的最高酶活力设为100%。研究过程中，分析了 酶在4〇°c、5(rc、6(rc条件下的温度稳定性。在各温度条件下，处理前的初始酶活力设为 100%。
[0031] 如图2A所示，果糖基转移酶的最适反应温度为55°C。当反应温度低于55°C时，随 着温度的逐渐升高，果糖基转移酶的酶活力逐渐增加。在最适反应温度（55°C)条件下，果 糖基转移酶的酶活力是30°C条件下酶活力的2. 3倍。但当温度高于55°C时，随着反应温度 的逐渐升高，果糖基转移酶的酶活力迅速降低。当反应温度为70°C时，果糖基转移酶的酶 活力仅为55°C时酶活力的25. 4%。对于果糖基转移酶的热稳定性，分别分析了酶在40°C、 50°C、6(rC条件下的稳定性（图2B)。在40°C条件下，处理60min，果糖基转移酶基本不失 活（酶活力残留> 95% )，该说明其在该温度条件下稳定。在50°C条件下，处理60min，果 糖基转移酶酶活力残留约为60%，该说明其在该温度条件下也较稳定。
[003引实施例4神对果糖基转移酶酶活力与稳定性的影响
[0033] 酶的最适抑是在不同抑条件下进行分析的，如抑3. 0~8. 0 (磯酸-巧樣酸缓 冲液，lOOmM)。在不同抑条件下测定的最高酶活力设为100%。酶抑稳定性测定的前处理 条件为：不同抑缓冲液、25°C保温2化。采用的缓冲液为；磯酸-巧樣酸缓冲液（lOOmM，抑 3. 0~8. 0)、磯酸缓冲液（lOOmM，pH8. 0~9. 0)、甘氨酸-NaOH缓冲液（lOOmM，pH9. 0~ 11.0)。在不同抑缓冲液处理条件下，测得的最高残留酶活力设为100%。果糖基转移酶 的最适抑为5. 5 (图3A)。当抑< 5. 5时（3. 0~5. 5)，随着抑值的增加，果糖基转移酶 的相对酶活力逐渐增大。果糖基转移酶在pH5. 5条件下的酶活力为pH3.0条件下酶活力 的4倍。但当抑> 5. 5时，随着抑值的增加，果糖基转移酶的相对酶活力迅速降低。如图 3B所示，分析了果糖基转移酶在抑2.0~11.0条件下的稳定性。在抑6.0条件下，果糖 基转移酶最为稳定。在抑4.0~9.0条件下，果糖基转移酶的稳定性较高（酶活力残留> 90%)。由此可确定，果糖基转移酶具有较宽的抑稳定范围。实施例5;果糖基转移酶催化 庶糖生产低聚果糖
[0034] 采用上述果糖基转移酶催化底物庶糖（600g/L)，40°C条件催化处理12h，采用 HPLC测定反应体系中低聚果糖的浓度。通过测定分析计算，确定低聚果糖的含量可达 57. 3% (w/w) 〇
【主权项】
1. 一种果糖基转移酶FWTOl，其特征在于： 1) 由序列1所示氨基酸序列组成的蛋白质； 2) 将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或 添加且具有果糖基转移酶功能的由序列表序列1衍生的序列相似度大于90%的蛋白质。
2. -种果糖基转移酶基因FWT-01，其特征在于，编码权利要求1所述的果糖基转移酶 FffTOlo
3. 根据权利要求2所述果糖基转移酶基因FWT-01，其特征在于： 1) 其DNA序列如序列2所示； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有果糖基转移酶活性蛋白的DNA 分子； 3) 与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有果糖基转移酶活性蛋 白的DNA分子。
4. 包含权利要求2或3所述的果糖基转移酶基因FWT-Ol的重组载体。
5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体可使果糖基转移酶在毕 赤酵母（Pichiapastoris)、大肠杆菌（Escherichiacoli)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)等宿主中进行异源表达。
6. -种制备果糖基转移酶FWT的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 用权利要求4的重组载体转化宿主细胞P.pastoris、E.coli或S.cerevisiae，得重 组菌株。 2) 培养重组菌株，实现重组果糖基转移酶表达。 3) 回收并纯化所表达的果糖基转移酶FWTOl。
7. 权利要求1所述果糖基转移酶的应用，其主要应用于催化蔗糖生产低聚果糖，其中 蔗糖浓度为5-900g/L。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，一种果糖基转移酶FWT01及其编码基因与应用。本发明提供了一种来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的果糖基转移酶FWT01，其氨基酸序列如序列1所示，且本发明提供了编码上述果糖基转移酶的编码基因FWT-01。本发明的果糖基转移酶具有以下性质：1)可在毕赤酵母(Pichia pastoris)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等宿主中异源表达；2)具有较宽的温度稳定性性，在50以下酶稳定；3)具有较宽的pH稳定范围：在pH4.0-9.0条件下稳定(酶活力残留＞90％)；4)具有高低聚果糖转化率，其浓度为57.3％(w/w)。
【IPC分类】C12N15-70, C12N9-10, C12R1-19, C12N15-81, C12R1-865, C12P19-18, C12N15-54, C12R1-84
【公开号】CN104774817
【申请号】CN201510179542
【发明人】杨海泉, 沈微, 陈献忠, 杨海麟, 马道程, 樊游
【申请人】江南大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月15日