的梯度增加到 30g/L，每增加一次NaCl的浓度，待菌体增长量稳定后，继续增加NaCl的浓度，逐级驯化出 耐盐混合微生物菌群；枯草芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和产黄青霉； (3) 强化耐盐菌种培养：将筛选得到的强化耐盐微生物在相应的液体培养基上扩大培 养，枯草芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌在30°C，180r/min培养ld，产黄青霉在28°C，220r/min 培养3d，选用600 nm (真菌用560 nm)波长进行比池测定，以菌悬液的0D值为纵坐标，培 养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；所述的液体培养基指的是马丁氏培养基； (4) 强化复合微生物菌剂制备：菌种培养：将筛选得到的强化耐盐微生物在相应的液 体培养基上扩大培养，枯草芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌在30°C，180r/min培养ld，产黄青 霉在28°C，220r/min培养3d。选用600 nm (真菌用560 nm)波长进行比浊测定，以菌悬液 的0D值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，选取对数生长期的菌种配 置复合微生物菌剂，复合微生物菌液按以下处理进行配制，枯草芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌 和产黄青霉按重量份数比为1:1:1的比例进行配置，所述的液体培养基指的是马丁氏培养 基。
[0012] 本发明更进一步公开了采用强化垃圾堆肥微生物菌剂提高草皮抗盐性的方法，其 特征在于按如下的步骤进行： (1) 实验材料：选用草坪草选取籽粒饱满、均勾一致的高羊茅aryflt/iflacea L .)种子为试验材料； 实验基质盐碱土取自河北省黄骅市海边，pH 8. 0,含盐量1. 58% ; 校园土 ：pH为7. 44,含盐量0.29%，有机质含量4.68 %，全氮量0.21 %，有效磷含量 22.0311^.1^1，全钟45.618.1^1，容重0.46 8.1^1，饱和含水量0.58 8.1111^1; (2) 强化复合微生物菌剂制备：将筛选得到的强化耐盐微生物在相应的液体培养基上 扩大培养，枯草芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌在30°C，180r/min培养ld，产黄青霉在28°C， 220r/min培养3d，选用600 nm (真菌用560 nm)波长进行比池测定，以菌悬液的0D值为纵 坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，选取对数生长期的菌种配置强化复合微 生物菌剂，其中强化枯草芽孢杆菌，强化赖氨酸芽孢杆菌和强化产黄青霉的重量份数比为 1:1:1 ;所述的液体培养基指的是马丁氏培养基； (3) 强化复合微生物菌剂的应用：将盐碱土按照盐胁迫处理水平：轻度含盐量为0. 3%， 中度含盐量为〇. 6%和重度含盐量为0. 9% (属于常规方法)。
[0013] (4)草坪草盐胁迫建植 实验材料选用的是我国北方比较常见的多年生高羊茅，所用基质为配制好的不同盐梯 度的土壤，在121°C下灭菌30min，备用；实验时灭菌土壤作为基质，建植地毯草皮基质厚度 为15-18mm，播种量为160-165g ? m_2,每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状 况，并且应经常调换草皮培养位置，以保证光照一致，当植株生长高度达到6-7cm时，加入 不同处理的复合微生物菌剂，实验在温室植物培养台上进行，温度为20-28°C，相对湿度为 35。/『60%，光照为自然光，处理35d后进行植物各指标的测定；所述的灭菌土壤指的是：配制 好的不同盐梯度的土壤，在121°C下灭菌30min。
[0014] 需要特别说明是： 本发明所用到的枯草芽孢杆菌（保藏号CCTCCM207094)、赖氨酸芽孢杆菌和产黄青霉 市场上均有销售，本发明的方法既可以采用市场上有售的枯草芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌 和产黄青霉进行驯化制成强化复合菌剂，也可以采用本发明公开的方法从生活垃圾堆肥中 分离得到枯草芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和产黄青霉，然后再经过驯化制成复合菌剂。其得 到的3个菌株的生化特性与市售的相同故未在保藏。
[0015] 本发明更加详细的描述如下： 1研制材料与方法 1. 1实验材料 草坪草选取籽粒饱满、均勾一致的高羊茅aryflt/iaacea L .)种子为试验材 料。实验基质盐碱土取自河北省黄骅市海边，pH 8.0,含盐量1.58%。校园土 ：pH为7. 44， 含盐量0. 29%，有机质含量4. 68 %，全氮量0. 21 %，有效磷含量22. 03mg ? kg4，全钾45. 61 g ? kg-1，容重 0? 46 g ? I71，饱和含水量 0? 58 g ? ml/1。
[0016] 1. 2垃圾堆肥中耐盐微生物的强化、分离、纯化和鉴定。
[0017] 培养基 富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15§琼脂成固 体培养基； 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7. 0-7. 2,加15g 琼脂成固体培养基； 高氏 I 号培养基：可溶性淀粉20g，KN03 20g，K2HP03 0? 5g，MgS04 0? 5g，FeS04 0? Olg，水 1000ml，pH 7. 2-7. 4,加琼脂20g成固体培养基(配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状， 导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至l〇〇〇ml); 马丁氏培养基：葡萄糖l〇g，蛋白胨5g，KHP03 lg，MgS0(7H20) 0. 5g，l%孟加拉红水溶 液，3. 3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基(临用前加入0. 03%链霉素稀释液 100ml，使每ml培养基含链霉素30呢）。
[0018] 菌种的富集 将堆肥样品称取l〇g置于无菌锥形瓶中，加入lOOmL无菌水振荡均勾后，取10mL悬浮 液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28°C，220r/min下振荡培养3d，即为混合微生 物菌群。
[0019] 微生物的强化 混合微生物菌群耐盐强化采用的是逐步增加盐浓度的方法，以减轻瞬间高浓度盐对混 合菌株造成的冲击和毒害。未经过驯化的混合菌群一般在NaCl浓度为5g/L的条件下生长 较好，而此次研宄的目标NaCl浓度为30g/L，即在本研宄中NaCl的浓度分别为0. 5%、1%、 1. 5%、2%、2. 5%和3%。在驯化过程中，视0D_增长而逐步提高盐浓度，NaCl的浓度以5g/L 的梯度增加到30g/L，每增加一次NaCl的浓度，要待菌体增长量稳定后，才能继续增加NaCl 的浓度，逐级驯化出耐盐混合微生物菌群。
[0020] 强化微生物的分离及纯化 稀释涂布平板法 1)倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏（PDA)琼脂培 养基高温灭菌，冷却至55~60°C时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液(终质量浓度为 30l^g/ml )，混均匀后分别倒平板。
[0021] 2)制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛 有9ml无菌水的大试管中充分混勾，此为KT1稀释液，以此类推制成10'10'10'101口 1〇_6几种浓度的稀释液。
[0022] 3)涂布：用移液枪分别吸取0. 2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平 板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次。用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
[0023] 4)培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C培养箱中培养，将含高氏I号培养基和马 丁氏培养基（PDA)的平板倒置于28°C培养箱中培养。
[0024] 平板划线分离法 挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划 线纯化。直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤。
[0025] 强化微生物的鉴定 按照Ezup柱式试剂盒的操作手册提取优势菌种的DNA。优势细菌的PCR体系： 10 X Buffer (with MgCl2)2 dNTP (10mmol/L)0. 4m, 341f (10Mmol/L)mL, 534r (lOMmol/ L) 1ML，Taq酶（5u/ML) 0. 4ML，模板DNA 1ML，加超纯水定容至终体积20ML。PCR反应条件： 94°C 5min 预变性，94°C变性 lmin，55°C复性 45s，72°C延伸 45s，30 个循环，72°C延伸 lOmin。 引物为 341f (5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')和 534r (5' -AIT ACC GCG GCT GCT GG-3')。优势真菌的 PCR 反应体系：l〇XBuffer (without MgCl2)2 ML，MgCl2 (25mmol/L)1.6ML，dNTP (lOmmol/L) 0? 4ML，Geoll (10Mmol/L)0. 4ML，GeoA2 (10Mmol/L)0. 4ML，Taq 酶（5u/ML)0. 2ML，模板 DNA 1ML，加超纯水定容至终体积20ML。PCR反应条件：94°C 4min预变性，94°C变性lmin，54°C复 性 lmin，72°C延伸 2