min，30 个循环，72°C延伸 7min。引物为 GeoA2 (5' -CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3，）和 Geoll (5' -ACC TTG TTA CTT TTA CTT CC-3'）。将得到的 PCR 产物送到北京华大基因测序部，根据测序的结果，在BLAST系统中找出对应菌种。
[0026] 1. 3复合微生物菌剂制备 菌种培养：将筛选得到的强化耐盐微生物在相应的液体培养基上扩大培养。枯草芽孢 杆菌和赖氨酸芽孢杆菌在30°C，180r/min培养ld，产黄青霉在28°C，220r/min培养3d。选 用600 nm (真菌用560 nm)波长进行比池测定，以菌悬液的0D值为纵坐标，培养时间为横 坐标，绘制微生物的生长曲线。选取对数生长期的菌种配置复合微生物菌剂，复合微生物菌 液按以下处理进行配制。枯草芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和产黄青霉按1:1:1的比例进行 配置。
[0027] 1. 4复合微生物菌剂应用 将盐碱土按照不同比例与天津师范大学校内正常园土混合。本实验采用四个盐胁迫处 理水平：轻度(含盐量为0. 3%，以下简称0. 3%)，中度(含盐量为0. 6%，以下简称0. 6%)和重 度(含盐量为〇. 9%、1. 2%，以下简称0. 9%、1. 2%)盐碱土，分别用V T2、T#P T 4表示；不同浓 度的复合微生物菌剂应用，在相应的盐度条件下设定处理方式：处理1为对照，接种相应的 空白培养基（CK);处理2加入100倍稀释液的复合微生物菌剂（CM。；处理3加入200倍稀 释液的复合微生物菌剂（CM 2)。
[0028] 1. 5草皮建植 实验材料选用的是我国北方比较常见的多年生高羊茅。所用基质为配制好的不同盐梯 度的土壤。在121°C下灭菌30min，备用。实验时灭菌土壤作为基质，建植地毯草皮基质厚 度约为15mm，播种量为160g ?!!!'每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状况， 并且应经常调换草皮培养位置，以保证光照一致，当植株生长高度达到6-7cm时，加入不同 处理的复合微生物菌剂，各处理3次重复，实验在温室植物培养台上进行，温度为20-28°C， 相对湿度为35%-60%，光照为自然光，处理35d后进行植物各指标的测定。
[0029] 1. 6指标的测定 1. 6. 1株高与生物量 株高的测定：施加菌剂后，l〇d测第一次株高，后每10d测定一次，共3次。
[0030] 生物量的测定：将植物样放入电热鼓风干燥箱，105°C杀青15 min后，80°C烘干至 恒重。
[0031] 1.6. 2叶绿素含量的测定 叶绿素含量的测定采用分光光度法，即取〇. 2g的草坪植物地上部分置于研钵中，加入 少量石英砂、碳酸妈和80%丙酮，进行充分研磨提取，将匀衆转入15mL离心管中，并用适量 80%丙酮洗涤钵体，一并转入离心管中，离心后弃沉淀，取上清液转移至25mL容量瓶中，用 80%丙酮定容至刻度线；以80%丙酮作为对照，用SHIMADZU产UV-1700型紫外分光光度计 分别测定在663nm、645nm波长处的吸光度值。计算公式如下：
【主权项】
1. 一种强化耐盐微生物菌剂，其特征在于，它是由重量份数比为1: 1:1的强化枯草芽 孢杆菌、强化赖氨酸芽孢杆菌和强化产黄青霉组成；所述的强化枯草芽孢杆菌、强化赖氨酸 芽孢杆菌和强化产黄青霉指的是采用逐步增加盐浓度的方法逐级驯化得到的耐盐混合微 生物菌群。
2. 权利要求1所述强化耐盐微生物菌剂，其特征在于所述强化枯草芽孢杆菌、强化赖 氨酸芽孢杆菌和强化产黄青霉菌落数在（2.01 ±0. 13)XlO9AiL- (2. 45±0. 07)XlO9AiL 之间；其中强化枯草芽孢杆菌的OD6tltlnm值为0. 583,强化赖氨酸芽孢杆菌的OD_nm值为 0. 603〇
3. 强化耐盐微生物菌剂在提高草皮的抗盐性能方面的应用。
4. 强化耐盐微生物菌剂在增加高羊茅地上和地下生物量的积累方面的应用；所述强 化耐盐微生物菌剂指的是稀释100倍的强化耐盐微生物菌剂。
5. 强化耐盐微生物菌剂在增加高羊茅株高，减轻因盐胁迫对植株造成的伤害方面的应 用；所述强化耐盐微生物菌剂指的是稀释100倍的强化耐盐微生物菌剂。
6. 权利要求1所述强化耐盐微生物菌剂的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 配制盐的浓度（w/w):分别配制NaCl的浓度：0. 5%、1%、1. 5%、2%、2. 5%和3%备用； (2) 在驯化过程中，视OD6tltl增长而逐步提高盐浓度，NaCl的浓度以5g/L的梯度增加到 30g/L，每增加一次NaCl的浓度，待菌体增长量稳定后，继续增加NaCl的浓度，逐级驯化出 耐盐混合微生物菌群；枯草芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和产黄青霉； (3) 强化耐盐菌种培养：将筛选得到的强化耐盐微生物在相应的液体培养基上扩大培 养，枯草芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌在30°C，180r/min培养ld，产黄青霉在28°C，220r/min 培养3d，选用600nm(真菌用560nm)波长进行比池测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培 养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；所述的液体培养基指的是马丁氏培养基； (4) 强化复合微生物菌剂制备：菌种培养：将筛选得到的强化耐盐微生物在相应的液 体培养基上扩大培养，枯草芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌在30°C，180r/min培养ld，产黄青 霉在28°C，220r/min培养3d;选用600nm(真菌用560nm)波长进行比浊测定，以菌悬液的 OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，选取对数生长期的菌种配置复 合微生物菌剂，复合微生物菌液按以下处理进行配制，枯草芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和产 黄青霉按重量份数比为1: 1:1的比例进行配置，所述的液体培养基指的是马丁氏培养基。
7. -种采用强化垃圾堆肥微生物菌剂提高草皮抗盐性的方法，其特征在于按如下的步 骤进行： (1) 实验材料：选用草坪草选取籽粒饱满、均勾一致的高羊茅aryflt/iflaceaL.)种子为试验材料； 实验基质盐碱土取自河北省黄骅市海边，pH8. 0,含盐量1. 58% ; 校园土 ：pH为7. 44,含盐量0.29%，有机质含量4.68 %，全氮量0.21 %，有效磷含量 22.0311^.1^1，全钟45.618.1^1，容重0.46 8.1^1，饱和含水量0.58 8.1111^1; (2) 强化复合微生物菌剂制备：将筛选得到的强化耐盐微生物在相应的液体培养基上 扩大培养，枯草芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌在30°C，180r/min培养ld，产黄青霉在28°C， 220r/min培养3d，选用600nm(真菌用560nm)波长进行比池测定，以菌悬液的OD值为纵 坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，选取对数生长期的菌种配置强化复合微 生物菌剂，其中强化枯草芽孢杆菌，强化赖氨酸芽孢杆菌和强化产黄青霉的重量份数比为 1: 1:1;所述的液体培养基指的是马丁氏培养基； (3) 强化复合微生物菌剂的应用：将盐碱土按照盐胁迫处理水平：轻度含盐量为0. 3%， 中度含盐量为〇. 6%和重度含盐量为0. 9%不同比例与校园土混合； (4) 草坪草盐胁迫建植 实验材料选用的是我国北方比较常见的多年生高羊茅，所用基质为配制好的不同盐梯 度的土壤，在121°C下灭菌30min，备用；实验时灭菌土壤作为基质，建植地毯草皮基质厚度 为15-18mm，播种量为160-165g?m_2,每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状 况，并且应经常调换草皮培养位置，以保证光照一致，当植株生长高度达到6-7cm时，加入 不同处理的复合微生物菌剂，实验在温室植物培养台上进行，温度为20-28°C，相对湿度为 35%-60%，光照为自然光，处理35d后进行植物各指标的测定；所述的灭菌土壤指的是：配制 好的不同盐梯度的土壤，在121°C下灭菌30min。
【专利摘要】本发明公开了一种采用强化垃圾堆肥微生物菌剂提高草皮抗盐性的方法。其中的化耐盐微生物菌剂，它是由重量份数比为1:1:1的强化枯草芽孢杆菌、强化赖氨酸芽孢杆菌和强化产黄青霉组成。本发明就是采用逐步提高NaCl的浓度来强化城市生活垃圾堆肥中的微生物，最终筛选得到制备出的强化耐盐微生物菌剂。利用所得到的强化耐盐微生物枯草芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和产黄青霉，并将它们配制成不同浓度的复合微生物菌剂，接种到草皮建植体系中，目的是为筛选强化耐盐复合微生物菌剂的最适浓度，提高地毯草皮的抗盐性，为地毯草皮在盐碱土基质上的建植提供技术支撑。
【IPC分类】C12R1-125, C12N1-14, C12R1-07, A01G1-00, A01G7-06, C05F17-00, C12N1-20, C12R1-82
【公开号】CN104789494
【申请号】CN201510141073
【发明人】多立安, 赵树兰, 高星星
【申请人】天津师范大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月30日