高通量测序文库及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种高通量测序文库及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 基因突变的方式有多种，包括SNP、插入、缺失、融合等情况。其中SNP、插入和缺失 突变类型往往从DNA水平上就可以检测得到，而发生融合突变通常需要在RNA水平上才能 检测到。
[0003] 目前，针对DNA水平（SNP、插入、缺失）的基因突变检测方法主要有ARMS(突变扩 增阻滞系统）和Sanger测序法。ARMS:利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA 互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引 物3'碱基与模板碱基互补配对时才能出现目的PCR扩增带，从而检测出突变。该法检测样 本有限，易受污染，且假阳性率高。Sanger测序法：依据双脱氧末端终止法，反应体系中合 成以共同引物为5'端，以双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。根据片段3' 端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。该法灵敏度较低，且实验操作较 为复杂、实验周期较长、易受污染，并且检测样本数据有限。
[0004] 针对RNA水平（融合）的基因突变的检测方法主要有RT-PCR法和FISH(荧光原位 杂交技术）。RT-PCR法：RT-PCR法一般分为两步：先将待检测标本的mRNA逆转录为cDNA， 再结合特异性引物对目标片段进行荧光PCR扩增，根据扩增片段的大小来检测是否存在融 合。该法操作复杂，易受污染，检测样本有限，只能检测已知突变类型。FISH:是利用荧光标 记的特异核酸探针与细胞内相应的靶分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下 观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结 合了荧光探针的靶分子在染色体或其他细胞器中的定位。该法成本高，技术难度较大，检测 样本有限。
[0005] 由于在同一基因内，有可能仅发生上述一种类型的突变，也有可能同时具有两种 或两种以上的突变类型。上述检测方法往往一次只能检测一个样本的一种类型变异，无法 同时应对多样本、多基因、多检测类型的需求。然而，新兴的二代高通量测序技术为多基因、 多类型突变的平行获取带来了希望。基于多重PCR的高通量测序方法能够在提高通量的同 时节省样品降低成本，能实现数十个、百个甚至数千个位点的快速测序及低频率等位基因 的检测。
[0006] 和其它高通量测序方法相比，基于多重PCR的高通量测序方法的难点就在如何提 供一种适合进行多个目的片段、多个基因同时进行扩增的多重PCR的引物混合物。由于涉 及的引物对较多，众多引物对混合在一起进行PCR扩增时容易相互之间产生影响，导致引 物二聚体的增加、扩增效率和特异性下降以及非特异性目的片段的扩增，从而导致无法同 时扩增得到多个目的片段。因而，在基于多重PCR的高通量测序方法所带来的优势已经被 众人所知时，其在多基因、多片段的多种突变类型的平行获取方面的应用却仍然受到限制。
[0007] 因此，如何有效地利用上述基于多重PCR的高通量测序方法来进行多样本、多基 因、多突变类型的平行获取，是目前亟待解决的一个技术问题。
【发明内容】
[0008] 本发明的主要目的在于提供一种高通量测序文库及其构建方法，提供一种能够对 多样本、多基因、多突变类型进行平行获取的方法。
[0009] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种高通量测序文库的构建 方法，该文库构建方法包括以下步骤：S1，利用引物混合物对多个目标区域进行多重PCR， 得到多个目标片段；S2,对多个目标片段接头连接，得到多个带接头的目标片段；以及S3， 对多个带接头的目标片段进行乳液PCR，得到高通量测序文库；其中，引物混合物为cDNA引 物混合物和/或DNA引物混合物；当混合引物为cDNA引物混合物时，cDNA引物混合物包括 SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示的第1对引物以及SEQIDNO:3和SEQIDN0:4所示 的第2对引物；当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物包括SEQIDNO:5和SEQ IDNO:6所示的第3对引物以及SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的第4对引物。
[0010] 进一步地，当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQIDNO:9 和SEQIDNO:10所示的第5对引物、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示的第6对引物以 及SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示的第7对引物。
[0011] 进一步地，当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQIDNO: 15 和SEQIDNO: 16所示的第8对引物、SEQIDNO: 17和SEQIDNO: 18所示的第9对引物、 SEQIDNO: 19 和SEQIDNO:20 所示的第 10 对引物、SEQIDNO:21 和SEQIDNO:22 所示 的第11对引物、SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示的第12对引物、SEQIDNO:25和SEQ IDNO:26所示的第13对引物以及SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示的第14对引物。
[0012] 进一步地，当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQIDNO:29 和SEQIDNO:30所示的第15对引物、SEQIDNO:31和SEQIDNO:32所示的第16对引 物、SEQIDNO:33 和SEQIDNO:34 所示的第 17 对引物、SEQIDNO:35 和SEQIDNO:36 所示的第18对引物、SEQIDNO:37和SEQIDNO:38所示的第19对引物、SEQIDNO:39 和SEQIDNO:40所示的第20对引物以及SEQIDNO:41和SEQIDNO:42所示的第21对 引物。
[0013] 进一步地，当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQIDNO:43 和SEQIDNO:44所示的第22对引物、SEQIDNO:45和SEQIDNO:46所示的第23对引 物、SEQIDNO:47 和SEQIDNO:48 所示的第 24 对引物、SEQIDNO:49 和SEQIDNO:50 所示的第25对引物、SEQIDNO:51和SEQIDNO:52所示的第26对引物、SEQIDNO:53 和SEQIDNO:54所示的第27对引物以及SEQIDNO:55和SEQIDNO:56所示的第28对 引物。
[0014] 进一步地，当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQIDNO:57 和SEQIDNO:58所示的第29对引物、SEQIDNO:59和SEQIDNO:60所示的第30对引 物、SEQIDNO:61 和SEQIDNO:62 所示的第 31 对引物、SEQIDNO:63 和SEQIDNO:64 所示的第32对引物、SEQIDNO:65和SEQIDNO:66所示的第33对引物、SEQIDNO:67 和SEQIDNO:68所示的第34对引物以及SEQIDNO:69和SEQIDNO:70所示的第35对 引物。
[0015] 进一步地，当混合引物为cDNA引物混合物时，cDNA引物混合物还包括SEQIDNO: 71和SEQIDNO:72所示的第36对引物以及SEQIDNO:73和SEQIDNO:74所示的第37 对引物。
[0016] 进一步地，当混合引物为cDNA引物混合物时，cDNA引物混合物还包括SEQIDNO: 75和SEQIDNO:76所示的第38对引物、SEQIDNO:77和SEQIDNO:78所示的第39对 引物以及SEQIDNO:79和SEQIDNO:80所示的第40对引物。
[0017] 进一步地，在步骤S1之后，以及步骤S2之前，方法还包括对多个目标片段两端的 引物序列进行消化的步骤。
[0018] 进一步地，在步骤S1中，当采用cDNA引物混合物对多个目标区域进行多重PC