量测序文库，该文库通过 上述任一种构建方法构建而成。采用本发明的方法所构建的高通量测序文库，因同时包含 多样本、多基因的多突变类型，因而能够对多样本、多基因的突变类型进行同时检测，能大 大提高检测效率及准确性。
[0044] 下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。
[0045] 需要说明的是，下列实施例中如无特殊标注，所有试剂均来自于Life Technologies公司。
[0046] 1.从1个肺组织的FFPE(福尔马林固定石蜡包埋）样本中提取核酸并纯化。
[0047] 2.〇111^(荧光定量计）对0嫩和1?隱分别进行定量，确定样本的0嫩浓度为 20. 5ng/y1，RNA浓度为 15. 6ng/y1。
[0048] 3.利用表1所示的反转录体系，在42°C保持30min;然后升温至85°C保持5min; 最后在10°C保温的反转录反应条件下，对RNA进行反转录，得到cDNA。
[0049]表1:
【主权项】
1. 一种高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤： S1，利用引物混合物对多个目标区域进行多重PCR，得到多个目标片段； 52, 对多个所述目标片段进行接头连接，得到多个带接头的目标片段；以及 53, 对多个所述带接头的目标片段进行乳液PCR，得到所述高通量测序文库； 其中，所述引物混合物为cDNA引物混合物和/或DNA引物混合物； 当所述混合引物为cDNA引物混合物时，所述cDNA引物混合物包括SEQIDNO: 1和SEQ IDNO:2所示的第1对引物以及SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的第2对引物； 当所述混合引物为DNA引物混合物时，所述DNA引物混合物包括SEQIDNO:5和SEQ IDNO:6所示的第3对引物以及SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的第4对引物。
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，当所述混合引物为DNA引物混合物 时，所述DNA引物混合物还包括SEQIDNO:9和SEQIDNO: 10所示的第5对引物、SEQID NO: 11和SEQIDNO: 12所示的第6对引物以及SEQIDNO:13和SEQIDNO: 14所示的第 7对引物。
3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，当所述混合引物为DNA引物混合物 时，所述DNA引物混合物还包括SEQIDNO: 15和SEQIDNO: 16所示的第8对引物、SEQ IDNO: 17和SEQIDNO: 18所示的第9对引物、SEQIDNO: 19和SEQIDNO:20所示的第 10 对引物、SEQIDNO:21 和SEQIDNO:22 所示的第 11 对引物、SEQIDNO:23 和SEQID NO:24所示的第12对引物、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示的第13对引物以及SEQ IDNO:27和SEQIDNO:28所示的第14对引物。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的构建方法，其特征在于，当所述混合引物为DNA 引物混合物时，所述DNA引物混合物还包括SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示的第15对 引物、SEQIDNO:31 和SEQIDNO:32 所示的第 16 对引物、SEQIDNO:33 和SEQIDNO: 34所示的第17对引物、SEQIDNO:35和SEQIDNO:36所示的第18对引物、SEQIDNO: 37和SEQIDNO:38所示的第19对引物、SEQIDNO:39和SEQIDNO:40所示的第20对 引物以及SEQIDNO:41和SEQIDNO:42所示的第21对引物。
5. 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，当所述混合引物为DNA引物混合物 时，所述DNA引物混合物还包括SEQIDNO:43和SEQIDNO:44所示的第22对引物、SEQ IDNO:45 和SEQIDNO:46 所示的第 23 对引物、SEQIDNO:47 和SEQIDNO:48 所示的第 24 对引物、SEQIDNO:49 和SEQIDNO:50 所示的第 25 对引物、SEQIDNO:51 和SEQID NO:52所示的第26对引物、SEQIDNO:53和SEQIDNO:54所示的第27对引物以及SEQ IDNO:55和SEQIDNO:56所示的第28对引物。
6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，当所述混合引物为DNA引物混合物 时，所述DNA引物混合物还包括SEQIDNO: 57和SEQIDNO: 58所示的第29对引物、SEQ IDNO:59 和SEQIDNO:60 所示的第 30 对引物、SEQIDNO:61 和SEQIDNO:62 所示的第 31 对引物、SEQIDNO:63 和SEQIDNO:64 所示的第 32 对引物、SEQIDNO:65 和SEQID NO:66所示的第33对引物、SEQIDNO:67和SEQIDNO:68所示的第34对引物以及SEQ IDNO:69和SEQIDNO:70所示的第35对引物。
7. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，当所述混合引物为cDNA引物混合物 时，所述cDNA引物混合物还包括SEQIDNO:71和SEQIDNO:72所示的第36对引物以及 SEQIDNO:73和SEQIDNO:74所示的第37对引物。
8. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，当所述混合引物为cDNA引物混合物 时，所述cDNA引物混合物还包括SEQIDNO:75和SEQIDNO:76所示的第38对引物、SEQ IDNO:77和SEQIDNO:78所示的第39对引物以及SEQIDNO:79和SEQIDNO:80所示 的第40对引物。
9. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤Sl之后，以及所述步骤 S2之前，所述方法还包括对多个所述目标片段两端的引物序列进行消化的步骤。
10. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤Sl中， 当采用所述cDNA引物混合物对多个目标区域进行多重PCR时，所述多重PCR的条件 为：第一步：96~99°C预变性2~4min;第二步：96~99°C变性15~20s;第三步：58~ 60°C退火延伸4~5min;然后第二步至第三步循环28~32次，最后，4~KTC保温。 当采用所述DNA引物混合物对多个目标区域进行多重PCR时，所述多重PCR的条件为： 第一步：96~99°C预变性2~4min;第二步：96~99°C变性15~20s;第三步：58~60°C 退火延伸4~5min;第二步至第三步循环18~25次，最后，4~10°C保温。
11. 一种高通量测序文库，其特征在于，所述高通量测序文库采用权利要求1至10中任 一项所述的构建方法构建而成。
【专利摘要】本发明公开了一种高通量测序文库及其构建方法。该方法包括：S1，用引物混合物进行多重PCR得到多个目标片段；S2，对多个目标片段接头连接得到多个带接头的目标片段；和S3，对多个带接头的目标片段进行乳液PCR得到高通量测序文库；引物混合物为cDNA引物混合物和/或DNA引物混合物；cDNA引物混合物包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示第1对引物以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示第2对引物；DNA引物混合物包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示第3对引物以及SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示第4对引物。该方法可有效提高检测通量。
【IPC分类】C40B40-06, C40B50-06
【公开号】CN104790042
【申请号】CN201510223995
【发明人】曹志生, 李宗文, 张宝亮, 张兰英, 丁雪, 宋超, 孟雪红, 魏龙刚, 尹静妮, 刘聪
【申请人】天津诺禾致源生物信息科技有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月5日