采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0033] 其中，脂肪干细胞完全培养基购自广州仪涛科学仪器有限公司
[0034] 成纤维细胞无血清培养基购自广州仪涛科学仪器有限公司
[0035] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0036] 实施例1人脂肪干细胞（ADSCs)的分离与培养
[0037] 通过脂肪抽吸术获取的人体腹部皮下脂肪组织抽提液（术前己排除内分泌疾病 及传染病）800g离心，用PBS缓冲液冲洗，浸泡，再800gx4min洗涤3次。
[0038] 剔除肉眼可见的血管及结蹄组织，用眼科剪将其充分剪碎后放入50ml离心管，加 入2倍体积0. 5 %胶原酶、1倍体积1 % BSA和双抗，混勾，封口，放入摇床中37°C消化50min， 至糊状为止。
[0039] 加入等体积的含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM终止消化，1800r/min离心 lOmin，离心后分为3层，上层为油脂及未消化完全的脂肪组织，中层为上清液，下层为脂肪 干细胞和红细胞等混合细胞的沉淀。
[0040] 弃上层和中层，下层加入完全培养基重悬细胞沉淀，70um细胞筛网过滤，
[0041] 将滤过后的滤液调整细胞浓度为5x10s单核细胞/mL接种于T-25cm 2培养瓶中， 37°C、5% CO2、饱和湿度培养。
[0042] 48h后换液，加入脂肪干细胞完全培养基继续培养。
[0043] 细胞培养至80%融合时，采用0. 25%胰蛋白酶/0. 02% EDTA消化传代至第三代~ 第五代。
[0044] 期间用倒置显微镜观察，观察结果如图1所示，结果显示：原代细胞培养24h后，可 见少量细胞贴壁；48h后（图Ι-a)，倒置显微镜下见圆形、短梭形、不规则形细胞；换液后， 细胞迅速生长，梭形细胞明显增多，部分细胞可见多个突起，4-5天（图Ι-b)开始单层融合， 呈成纤维样细胞，生长迅速，3天传代一次，随着代数增多，细胞形态逐渐均一。
[0045] 实施例2人脂肪干细胞（ADSCs)表面标记的鉴定
[0046] 取对数生长期第3代的细胞，吸出培养基后，加入0. 25 %胰蛋白酶+0.02 % EDTA 的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。
[0047] 1000 rpm,离心10min，弃上清，用4°C遇冷的PBS洗涤细胞3次后重悬均匀，调整细 胞浓度约为IO5-IO 6个/ml。
[0048] 取2个上样管，每管加入500ul的单细胞悬液，离心后1号管标为标准对照，2号各 加入2 μ IFITC或PE标记的小鼠抗人细胞表面分子⑶59、⑶45、⑶34、⑶105抗体工作液。
[0049] 室温，避光，孵育20min。
[0050] PBS洗两遍，以去除未结合的抗体，500ul的1640培养基重悬后，上流式细胞仪鉴 定表面标记。
[0051] 鉴定结果如图2所示，以未加抗体的实验为对照，流式细胞仪检测ADSCs表面抗原 显示：扩增第3代的ADSCs⑶59、⑶90呈阳性表达，而HLA-DR、⑶45呈阴性表达，符合干细 胞的特性。
[0052] 实施例3人脂肪干细胞向成纤维细胞的诱导分化及鉴定
[0053] 取实施例1制得的第三代~第五代的ADSCs，吸出培养基后，加入0. 25%胰蛋白酶 +0. 02% EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化。
[0054] 1200rpm离心5min，脂肪干细胞完全培养基重悬，调整密度为lxl04/ml，接种于6 孔板中，每孔2ml。
[0055] 当细胞达到40% -50%融合时，应用表1所示培养基，同样环境下诱导培养，每2 天更换诱导培养基，培养7~10天后，取部分细胞检测相关指标，其余细胞用成纤维细胞完 全培养基继续培养、传代，每2天更换完全培养基一次。
[0056] 表1脂肪干细胞成表皮细胞诱导分化实验设计
[0057]
【主权项】
1. 一种诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法，其特征在于，将脂肪干细胞于磷酸 维生素C和bFGF存在条件下诱导培养，得到成纤维细胞。
2. 根据权利要求1提供的方法，其特征在于，所述诱导培养的培养基为含有5wt% FBS 的DMEM/F12培养基。
3. 根据权利要求1提供的方法，其特征在于，所述bFGF的浓度为5~15 y g/mL ;磷酸 维生素C的浓度为0. 5~I. 5mmol/L。
4. 根据权利要求1提供的方法，其特征在于，所述诱导培养的培养基中还包括地塞米 松。
5. 根据权利要求1提供的方法，其特征在于，所述地塞米松的浓度为0.01~ 0?2 y mol/L〇
6. 根据权利要求1提供的方法，其特征在于，所述诱导培养的时间为7d~10d，温度为 37 °C，0)2体积分数5 %，饱和湿度95 %。
7. 根据权利要求1提供的方法，其特征在于，所述脂肪干细胞在诱导培养前经胰蛋白 酶消化、融合，具体为：取第三代~第五代的脂肪干细胞，加入质量分数为0. 25%胰蛋白酶 和质量分数为〇. 02% EDTA进行消化，以血清终止消化后1200r/min离心5min，以DMEM/F12 培养基重悬细胞，调整密度为I X 104/mL，培养至40 %~50 %融合。
8. 根据权利要求1~7任一项提供的方法，其特征在于，所述诱导培养后，还包括扩增 培养、传代的步骤。
9. 根据权利要求1提供的方法，其特征在于，所述扩增培养、传代的培养基为表皮细胞 无血清培养基SFM。
10. 根据权利要求1提供的方法，其特征在于，所述扩增培养、传代的条件为温度为 37 °C，0)2体积分数5 %，饱和湿度。
【专利摘要】本发明涉及干细胞诱导领域，尤其涉及诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法。该方法为：将脂肪干细胞于磷酸维生素C和bFGF存在条件下诱导培养，得到成纤维细胞。经试验证明，采用本发明提供的方法，培养7～10天后细胞仍呈梭形或漩涡形状，虽然形状上与脂肪干细胞十分相似，但是对I型胶原的表达情况检测结果表明，培养后的细胞中I型胶原的表达量升高了124倍，显著优于对照组。说明，采用本发明提供的方法成功将脂肪干细胞诱导分化称为成纤维细胞，且分化速度优于对照组。继续扩增培养、传代过程中，细胞进一步的分化、扩增，从而能够获得更大量的成纤维细胞。
【IPC分类】C12N5-071
【公开号】CN104805051
【申请号】CN201510073477
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 马岩岩, 王小燕
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年2月10日