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[0057] gtccctgttccccgctcagagactcgaactttccaatgaataggagattal700
[0058] tcccaggtgcctgcgtccaggctggtgtctgggttctgtgccccttccccl750
[0059] accccaggtgtcctgtccattctcaggctggtcacatgggtggtcctaggl800
[0060] gtgtcctatgagagatgcaaagcgcctgaattttctgactcttcccatcal850
[0061] gaccccccaaagacacacgtgacccaccaccccatctctgaccatgaggcl900
[0062] caccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactga
[0063] 1950cctggcagcgggatggcgaggaccaaactcaggacactgagcttgtggag
[0064] 2000accagaccagcaggagatagaaccttccagaagtgggcagctgtggtggt
[0065] 2050gccttctggagaagagcagagatacacatgccatgtacagcatgaggggc2100
[0066] tgccgaagcccctcaccctgagatggggtaaggagggggatgaggggtca2150
[0067] tatctcttctcagggaaagcaggagcccttctggagcccttcagcagggt2200
[0068] cagggcccctcgtcttcccctcctttcccagagccatcttcccagtccac2250
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[0070] teatcggagctgtggtcgctactgtgatgtgtaggaggaagagctcaggt2350
[0071] agggaaggggtgaggggtggggtctgggttttcttgtcccactgggggtt2400
[0072] tcaagccccaggtagaagtgttccctgcctcattactgggaagcagcatc2450
[0073] cacacaggggctaatgcagcctgggaccctgtgtgccagcacttactctt2500
[0074] ttgtgcagcacatgtgacaatgaaggacggatgtatcaccttgatggttg2550
[0075] tggtgttggggtcctgatttcagcattcatgagtcaggggaaggtccctg2600
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[0078] tccttttgggtccaagacgaggaggttcctctaagatctcatggccctgc2750
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[0081] agctcacccaccccataattcctcctgtcccacgtctcctgcgggctctg2900
[0082] accaggtcctgtttttgttctactccagccagcgacagtgcccagggctc2950
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[0086] gtgtcatcacttaccatgactaaccagaatttgttcatgactgttgtttt3150
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[0089] ggcacctgaatgtgtctgcgtccctgttagcataatgtgaggaggtggag3300
[0090] agacagcccacccccgtgtccactgtgacccct
[0091] 另一方面，本发明提供了上述检测试剂盒的应用，即对样本的HLA-B*59:01基因 进行分型。
[0092] 例如，如本发明的实施例中所示，采用PCR-SSO法进行HLA-B*59:01基因的分型。
[0093] 具体而言，对HLA-B*59:01基因的分型的步骤如下：
[0094] 抽提样本中的DNA;
[0095] 对HLA的多态区域进行扩增；
[0096] 在扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记；
[0097] 将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影根据信号判断结果。
[0098] 其中，所述的探针针对PCR扩增产物设计并且固定在膜上。
[0099] 所述的样本可以是RNA、蛋白、细胞或者血清样本。
[0100] 最常见的情况下，所述的样本是离体的外周血。
[0101] 利用HLA-B*59:01基因的分析结果可以判断SJS和TEN。
[0102] 本发明的实验数据证明，HLA_B*59:01基因可作为预测醋甲唑胺所致SJS和TEN 的标记基因。
[0103] 实验结果显示，醋甲唑胺所致SJS和TEN患者中HLA-B*59:01阳性比例相比于正 常对照组及醋甲唑胺耐受组之间差异有统计学意义（如表3所示）。HLA-B*59:01与醋甲 唑胺结合模型如图1所示（醋甲唑胺与HLA-B*59:01结合模型图（图1A)与结合细节模型 图（1B))。
[0104] 本发明的具有实用性的例证为：
[0105] 1)可以利用本发明所介绍的HLA-B*59:01基因作为预测醋甲唑胺所致SJS和TEN 的标记基因。
[0106] 2)利用本发明提供的HLA-B*59:01基因可用于评价或制备醋甲唑胺使用前筛查 试剂盒。
[0107] 3)利用本发明提供的HLA-B*59:01分子可用于评价或制备醋甲唑胺所致药疹靶 向药物。
[0108] 本发明涉及的是一种人类白细胞抗原基因一HLA-B*59:01基因，它与醋甲唑胺所 致SJS和TEN发病相关。HLA-B*59:01基因可作为预测醋甲唑胺所致SJS和TEN的标记基 因。从患者的外周血中抽取DNA后，用现行的方法检测HLA-B*59:01基因，如PCR-SSO (序 列特异性寡核苷酸探针）方法。利用本发明提供的HLA-B*59:01基因检测试剂盒可用于醋 甲唑胺使用前筛查及筛选治疗醋甲唑胺所致SJS和TEN的靶向药物。前者可指导临床用 药，从而减少醋甲唑胺所致SJS和TEN的发生。后者主要靶向作用于HLA-B*59:01分子， 从而阻断其在发病中与醋甲唑胺或其代谢产物之间的相互作用。
【附图说明】
[0109] 图1是醋甲唑胺与HLA-B*59:01的结合模型图.其中，（A)是醋甲唑胺与 HLA-B*59:01结合前后的结构重叠图；(B)是醋甲唑胺与HLA-B*59:01结合细节图。
【具体实施方式】
[0110] 以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。
[0111] 实施例1
[0112] 1)收集和抽提基因
[0113] 醋甲唑胺所致SJS和TEN患者来自于中国上海复旦大学附属华山医院；
[0114] 诊断标准由 Roujeau 等人（Roujeau JC. Clinical heterogeneity of drug hypersensitivity. Toxicology2005; 209:123-129.)提出，即临床表现有表皮的大量剥脱 坏死、口腔粘膜糜烂，伴或不伴有严重的肝肾功能损害等系统并发症，其中，面积〈10%的称 为SJS; >30%的称之为TEN; 10%~30%的称为SJS/TEN重叠；在知情同意的前提下参加本课 题的研究，采集血液，并签署知情同意书；所有入组患者均通过病史及皮肤病理检查排除病 毒疹及毒性红斑等其他诊断，所有患者均在发疹前2个月内首次口服醋甲唑胺；本实验有 两组对照，其一是来自human MHC database (dbMHC)的283位健康人群，另外一组来自中国 东部地区的30例患者为醋甲唑胺耐受组，均口服醋甲唑胺大于3月且没有发生任何药物反 应；取样本血液300ul，按试剂盒说明书提取DNA，用紫外分光光度仪检测DNA浓度和纯度；
[0115] 2)检测HLA基因分型
[0116] 本发明采用 PCR-SSO 法(推荐 LABT? SSO 试剂盒-One Lambda, CA, USA)进行 HLA 基 因的分型，其原理是先对HLA的多态区域进行扩增，在扩增过程中对PCR产物进行同位素 或非同位素标记，然后针对PCR扩增产物根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针固定在 膜上，最后将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影根据信号判断结果；根据试剂盒标准 步骤进行HLA基因分型（即将DNA样本、底物、Taq酶、引物混合后混匀，加入扩增板中，按试 剂盒说明书中条件扩增，扩增产物进行杂交、染色和读板）；结果分析通过HLA Fusion软件 (One lambda, CA, USA, HLA Fusion3. 0)进行；
[0117] 3)HLA-B*59:01与醋甲唑胺所致SJS和TEN相关
[0118] 统计方法：利用SPSS16. 0计算Odds Ratio(OR)及其95%的可信区间，必要时使用 Haldane' s校正，选用卡方检验进行统计学分析，统计学的显著性水平设定为P小于0. 05 ;
[0119] 结果显示：共搜集到醋甲唑胺所致SJS和TEN患者7例，其中6例诊断为TEN，1 例为SJS (如表1所示)，醋甲唑胺耐受组30例；病例组和耐受组之间的年龄性别等一般 特征无统计学差异（如表2所示）；醋甲唑胺所致SJS和TEN患者中HLA-B*59:01阳性比例 相比于正常对照组及醋甲唑胺耐受组之间差异有统计学意义(如表3所示）；结果还显示： HLA-B*59 :01与醋甲唑胺结合前后结构模型(如图IA所示)，除此之外，醋甲唑胺可结合于 HLA-B*59:01分子的A结合槽(如图IB所示）。
[0120] 表1.醋甲唑胺所致SJS和TEN患者的临床特点
[0121]
【主权项】
1. 一种人类白细胞抗原基因的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有检测 人类白细胞抗原基因的核酸或者蛋白的试剂；所述的人类白细胞抗原基因是HLA-B*59:01 基因。
2. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有人类白细胞抗 原基因的扩增引物；或者标记探针。
3. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有人类白细胞抗 原基因的特异性抗体。
4. 权利要求1所述的检测试剂盒在对样本的HLA-B*59:Ol基因进行分型中的应用。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，采用PCR-SSO法进行HLA-B*59:01基因的 分型。
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，对HLA-B*59:01基因的分型的步骤如下： (1) 抽提样本中的DNA; (2) 对HLA的多态区域进行扩增； (3) 在扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记； (4) 将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影，根据信号判断结果。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的探针针对PCR扩增产物设计并且固 定在膜上。
8. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的样本是RNA、蛋白、细胞或者血清样 本。
9. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的样本是离体的外周血。
10. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，利用HLA-B*59:01基因的分析结果判断 Stevens-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症。
【专利摘要】本发明属于生物医药技术领域,涉及一种人类白细胞抗原基因--HLA-B*59:01基因的检测试剂盒，所述的HLA-B*59:01基因可作为预测醋甲唑胺所致SJS和TEN的标记基因。本发明中，获得患者的外周血抽取的DNA后,用PCR-SSO的方法检测HLA-B*59:01基因,本发明的HLA-B*59:01基因检测试剂盒可用于醋甲唑胺使用前筛查及筛选治疗醋甲唑胺所致SJS和TEN的靶向药物，前者可指导临床用药,从而减少醋甲唑胺所致SJS和TEN的发生，后者主要靶向作用于HLA-B*59:01分子,从而阻断其在发病中与醋甲唑胺或其代谢产物之间的相互作用。
【IPC分类】C12Q1-68, G01N33-68
【公开号】CN104862379
【申请号】CN201410064918
【发明人】骆肖群, 邢清和, 贺林, 杨凡萍, 陈圣安
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2014年2月25日