施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。PMD18-T质粒(又称pMD18-T载体):TaKaRa公司，产品目录 号为6011。
[0026] 实施例1、特异引物对、阳性对照和阴性对照的制备
[0027] -、特异引物对的制备
[0028] 用于检测ERCCl基因的C118T点突变的特异引物对由Fl和Rl组成。
[0029] Fl (序列表的序列 1) :5' -TGGCGAATATGGTGACAC-3' ；
[0030] Rl (序列表的序列 2) :5' -CTCATAGAACAGTCCAGAACA-3'。
[0031] 用于检测XRCCl基因的R194W点突变的特异性引物对由F2和R2组成。
[0032] F2 (序列表的序列 3) :5' -GTGAAGGAGGAGGATGAGA-3' ；
[0033] R2 (序列表的序列 4) :5' -CTGGCTGTGACTATGAAGG-3'。
[0034] 用于检测GSTPl基因的1105V点突变的特异性引物对由F3和R3组成。
[0035] F3 (序列表的序列 5) :5' -CATCCTTCCACGCACATC-3' ；
[0036] R3 (序列表的序列 6) :5' -CGTTACTTGGCTGGTTGAT-3'。
[0037] 用于检测ERCCl基因的Cl 18T点突变的特异引物对又称为引物对甲（靶序列 599bp)。用于检测XRCCl基因的R194W点突变的特异性引物对又称为引物对乙(靶序列 398bp)。用于检测GSTPl基因的I105V点突变的特异性引物对又称为引物对丙（靶序列 452bp)。
[0038] 分别合成引物对甲、引物对乙和引物对丙。
[0039] 二、阳性对照的制备
[0040] 将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的SmaI和HindIII酶 切位点之间，得到阳性对照质粒甲。
[0041] 将序列表的序列8所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的SmaI和HindIII酶 切位点之间，得到阳性对照质粒乙。
[0042] 将序列表的序列9所示的双链DNA分子插入pMD18_T质粒的SmaI和HindIII酶 切位点之间，得到阳性对照质粒丙。
[0043] 三、阴性对照
[0044] 阴性对照为去离子水。
[0045] 实施例2、特异引物对的灵敏度检测
[0046] 一、引物对甲的灵敏度检测
[0047] 以阳性对照质粒甲为模板，采用引物对甲进行PCR扩增。
[0048] PCR扩增体系的总体积为25 μ 1。PCR扩增体系含0. 5 μ M F1、0. 5 μ M Rl和IU热 启动 DNA 聚合酶。PCR 扩增体系分别含有 lOng/μ l、5ng/y l、2.5ng/y lUng/μ l、0.5ng/ μ 1、0· 25ng/y 1、0· lng/μ 1 或 0· 05ng/y 1 阳性对照质粒甲。
[0049] PCR扩增的程序均为：95°C 5分钟；95°C 30秒、53°C 30秒、72°C 30秒，30个循环； 72°C 10 分钟；15°C，保持。
[0050] 将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。图1中，tl至t8依次代 表阳性对照质粒甲的浓度为 IOng/ μ l、5ng/ μ 1、2. 5ng/ μ 1、Ing/ μ 1、0. 5ng/ μ 1、0. 25ng/ μ 1、0. lng/μ I或0.05ng/l·! I的体系。结果表明，引物对甲的灵敏度为lng/μ 1。
[0051] 分别回收各个目的条带并进行测序，结果准确。
[0052] 二、引物对乙的灵敏度检测
[0053] 以阳性对照质粒乙为模板，采用引物对乙进行PCR扩增。
[0054] PCR扩增体系的总体积为25 μ 1。PCR扩增体系含0. 5 μ M F2、0. 5 μ M R2和IU热 启动 DNA 聚合酶。PCR 扩增体系分别含有 lOng/μ l、5ng/y l、2.5ng/y lUng/μ l、0.5ng/ μ 10. 25ng/y 1、0· lng/μ 1 或 0· 05ng/y 1 阳性对照质粒乙。
[0055] PCR扩增的程序均为：95°C 5分钟；95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒，30个循环； 72°C 10 分钟；15°C，保持。
[0056] 将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。图2中，tl至t8依次代表 阳性对照质粒乙的浓度为 lOng/μ l、5ng/y 1、2· 5ng/y lUng/μ 1、0· 5ng/y 10. 25ng/y 1、 0· lng/μ 1或0.05ng/l·! 1的体系。结果表明，引物对乙的灵敏度为2.5ng/l·! 1。
[0057] 分别回收各个目的条带并进行测序，结果准确。
[0058] 三、引物对丙的灵敏度检测
[0059] 以阳性对照质粒丙为模板，采用引物对丙进行PCR扩增。
[0060] PCR扩增体系的总体积为25 μ 1。PCR扩增体系含0· 5 μ M F3、0. 5 μ M R3和IU热 启动 DNA 聚合酶。PCR 扩增体系分别含有 50ng/y l、25ng/y l、15ng/y l、10ng/y l、8ng/ μ l、5ng/y 1、2· 5ng/y I 或 lng/μ I 阳性对照质粒丙。
[0061] PCR扩增的程序均为：95°C 5分钟；95°C 30秒、53°C 30秒、72°C 30秒，30个循环； 72°C 10 分钟；15°C，保持。
[0062] 将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。图1中，Tl至T8依次代 表阳性对照质粒丙的浓度为 50ng/y l、25ng/y l、15ng/y lUOng/μ l、8ng/y l、5ng/y 1、 2. 5ng/l·! I或lng/μ I的体系。结果表明，引物对丙的灵敏度为lOng/μ 1。
[0063] 分别回收各个目的条带并进行测序，结果准确。
[0064] 实施例3、特异引物对的应用
[0065] 1、采集8位知情同意的志愿者的血样，提取基因组DNA。
[0066] 2、分别以步骤1提取的各个基因组DNA为模板，采用引物对甲进行PCR扩增(初始 PCR扩增体系中，基因组DNA的含量为30ng);设置用阳性对照质粒甲代替基因组DNA的阳 性对照处理，设置用阴性对照代替基因组DNA的阴性对照处理。
[0067] PCR扩增体系的总体积为25μ1，含0. 5μΜ F1、0. 5μΜ Rl和IU热启动DNA聚合 酶。
[0068] PCR扩增的程序均为：95°C 5分钟；95°C 30秒、53°C 30秒、72°C 30秒，30个循环； 72°C 10 分钟；15°C，保持。
[0069] 3、分别以步骤1提取的各个基因组DNA为模板，采用引物对乙进行PCR扩增(初始 PCR扩增体系中，基因组DNA的含量为30ng);设置用阳性对照质粒乙代替基因组DNA的阳 性对照处理，设置用阴性对照代替基因组DNA的阴性对照处理。
[0070] PCR扩增体系的总体积为25 μ 1，含0. 5 μ M F2、0. 5 μ M R2和IU热启动DNA聚合 酶。
[0071] PCR扩增的程序均为：95°C 5分钟；95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒，30个循环； 72°C 10 分钟；15°C，保持。
[0072] 4、分别以步骤1提取的各个基因组DNA为模板，采用引物对丙进行PCR扩增(初始 PCR扩增体系中，基因组DNA的含量为30ng);设置用阳性对照质粒丙代替基因组DNA的阳 性对照处理，设置用阴性对照代替基因组DNA的阴性对照处理。
[0073] PCR扩增体系的总体积为25 μ 1，含0. 5 μ M F3、0. 5 μ M R3和IU热启动DNA聚合 酶。
[0074] PCR扩增的程序均为：95°C 5分钟；95°C 30秒、53°C 30秒、72°C 30秒，30个循环； 72°C 10 分钟；15°C，保持。
[0075] 5、将步骤2、步骤3和步骤4的PCR扩增产物分别进行2%琼脂糖凝胶电泳，然后回 收目标条带并测序。各个样本均显示单一的扩增条带，且经测序扩增产物均为目标序列，也 就是说对于人基因组来说，引物对的特异性良好，不存在非特异性扩增。阳性对照质粒均与 预期结果一致，阴性对照均未显示任何PCR扩增条带。
[0076] 各个志愿者的检测结果见表1。
[0077] 表1各个志愿者的检测结果
[0078]
【主权项】
1. 引物组，由引物对甲、引物对乙和引物对丙组成；所述引物对甲由序列表的序列1所 示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述引物对乙由序列表的 序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述引物对丙由 序列表的序列5所不的单链DNA分子和序列表的序列6所不的单链DNA分子组成。
2. 权利要求1所述引物组在制备用于鉴定ERCCl基因的Cl 18T点突变、XRCCl基因的 R194W点突变和GSTPl基因的I105V点突变的试剂盒中的应用。
3. 权利要求1所述引物组在制备用于指导钼类药物用药的试剂盒中的应用。
4. 一种用于鉴定ERCCl基因的Cl 18T点突变、XRCCl基因的R194W点突变和GSTPl基 因的I105V点突变的试剂盒，包括权利要求1所述引物组。
5. -种用于指导钼类药物用药的试剂盒，包括权利要求1所述引物组。
【专利摘要】本发明公开了一种用于指导铂类药物用药的试剂盒。本发明保护一种引物组，由引物对甲、引物对乙和引物对丙组成；引物对甲由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；引物对乙由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成；引物对丙由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成。本发明还保护一种用于鉴定ERCC1基因的C118T点突变、XRCC1基因的R194W点突变和GSTP1基因的I105V点突变的试剂盒，包括所述引物组。本发明提供的试剂盒可用于检测与铂类药物敏感性相关的三个SNP位点，进而可以用于临床指导铂类药物的个体化使用，提高临床治疗的针对性和可预见性。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104862381
【申请号】CN201410066826
【发明人】文洁
【申请人】文洁
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2014年2月26日