PE 合成方程式。
[0042] 图2显示!fepG2-NTCP细胞成功表达NTCP。其中，a图显示采用RT-PCT和琼脂糖 凝胶电泳对NTCP DNA进行分析的结果，b图显示采用流式细胞术检测细胞表面上NTCP表达 的结果，c图显示采用共聚焦激光扫描显微镜（X400)检测细胞表面上NTCP表达的结果。
[0043] 图3显示共聚焦显微镜观察HBVpreS/13-32myl:与细胞结合情况。！fepG2-NTCP分 别与 HBVpreS/13-32，-FITC (a 图）、P印47-FITC (b 图）共孵育，或未处理（cl 一 c3 图）； !fepG2-pCMV细胞也分别与HBVpreS/mZ^-FITC (d图）、P印47-FITC (e图)共孵育，或未 处理（f图）。
[0044] 图 4 显示 HPLC 和 MALDI-T0F-MS 检测 HBVpreS/mZ-yr-PEG^Q-DSPE 合成过 程。其中，a图显示反应前HBVpreS/mZ1^的分析，b图显示反应后HBVpreS/13-32胃 r 的分析，c图显示反应物Mal-PEG2ticici-DSPE的MALDI-T0F-MS分析，d图显示产物 HBVpreS/13-32myr-PEG2_-DSPE 的 MALDI-T0F-MS 分析。
[0045] 图5显示脂质体的超微结构形态学观察和粒径大小分析。其中，a图显示采用电 子显微镜（乂210000)测定的耶￥?^5/2-21胃 1:修饰的脂质体的超微结构形态学，13图显示采 用电子显微镜（X 210000)测定的未修饰的脂质体的超微结构形态学，c图显示采用粒径大 小分析获得的HBVpreS/13-32 m!T修饰的脂质体粒径，d图显示显示采用粒径大小分析获得 的未修饰的脂质体的粒径。
[0046] 图6显示HBVpreS/13-32胃r修饰脂质体通过NTCP特异性靶向!fepG2-NTCP细胞， 其中，采用流式细胞术（a图）和共聚焦激光扫描显微镜（bl-b8, X400)检测得到FS递送到 细胞中的效率。
【具体实施方式】
[0047] 本发明通过采用与钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP)特异性结合的源于乙型 肝炎病毒外膜蛋白PreSl区的多肽与马来酰亚胺-聚乙二醇-硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚合 物而完成本发明。
[0048] 适合用于本发明的多肽尤其包括乙肝病毒外膜蛋白PreSl区的片段。应理解，多 肽的"片段"在本文中指，例如PreSl区的截短序列。片段的长度通常短于全长序列的长 度。例如，本申请中，PreSl区的片段可含有PreSl区第2-119位氨基酸，优选地含有PreSl 区第13-119位氨基酸，进一步优选地含有PreSl区第13-59位氨基酸，进一步优选地含有 PreSl区第13-49位氨基酸，进一步优选地含有PreSl区第13-39位氨基酸，进一步优选地 含有PreSl区第13-32位氨基酸。
[0049] 适用于本发明的PreSl区第2 -119位氨基酸序列可如SEQ IDN0:1所示。因此， 本发明多肽的例子可包括SEQ ID NO: 1所示的PreSl第13 - 32位氨基酸（SEQ ID NO: 3)、和 第13 - 59位氨基酸（SEQ ID NO: 2)。在其它实施例中，本发明多肽例子包括SEQ ID NO: 1所 示的第13-119位氨基酸、13-49位氨基酸，和第13-39位氨基酸等。在优选的实施例中，本 发明的多肽片段至少含有SEQ ID NO: 3,并能特异性与钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP) 结合。片段长度通常为20 - 55个氨基酸残基，优选20-50个氨基酸残基，优选20-47个氨 基酸残基，优选20-40个氨基酸残基。
[0050] 应理解，人们已知乙肝病毒外膜蛋白PreSl区的氨基酸序列，且现有技术也已知 能特异性与钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP)结合的PreSl区的片段及其确定某片段 是否与NTCP特异性结合的方法。采用现有技术，技术人员不难确定能特异性与钠离子-牛 磺胆酸共转运多肽（NTCP)结合的PreSl区的其它片段。这些片段都可用于本发明。多肽 的N端可进行脂肪酸修饰，本发明的一个例子就是对多肽的N端进行豆蘧酸(myr)修饰。
[0051] 适用于本发明化合物的马来酰亚胺-聚乙二醇-硬脂酰基磷脂酰乙醇胺可具有如 下式2所示的结构式：
[0053] 式2中，η为2 - 100的整数，DSPE为硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。
[0054] η的范围可为2 - 80的整数，优选5 - 50的整数，优选10 - 40的整数。
[0055] 或者，式2中，聚乙二醇的分子量在600 - 2500的范围之内，优选为1000 - 2500， 更优选为1500 - 2000。
[0056] 在本发明的一个具体实施例中，使用分子量为2000的聚乙二醇，即式2化合物为 Mal-PEG2_-DSPE。
[0057] 可通过在本发明多肽的C末端加入一个半胱氨酸残基，并通过该半胱氨酸残基的 巯基与式2的马来酰亚胺部分偶联。图1示出了这种偶联的一个例子。
[0058] 可利用本发明的式1、2、3和4化合物来制备脂质体组合物，用以递送感兴趣的药 物。本发明的脂质体组合物可含有本发明的式1、2、3或4化合物，磷脂酰胆碱、胆固醇、 PEG-DSPE。上述PEG-DSPE中的PEG的定义和上文相同。优选的是，PEG的分子量在600 - 2500的范围之内，优选为1000 - 2500,更优选为1500 - 2000。
[0059] 在一个具体实施例中，使用PEG2qqq-DSPE。
[0060] 本发明还包括一种药物组合物,该药物组合物含有本发明的脂质体组合物及感兴 趣的药物。
[0061] 可采用常规的方法制备本发明的药物组合物，例如采用乙醇注入法成脂质体形式 的本发明药物组合物。本发明脂质体形式的药物组合物的直径多在IOOnm以下。可通过调 整制备过程中的各项参数，例如搅拌方式、速率、时间等，来调整所得组合物中脂质体的粒 径大小。通常，可将其平均粒径大小控制在120nm以下。制备的脂质体通过激光粒度分析 仪检测脂质体颗粒粒径大小，透射电镜观察超微结构形态，多功能酶标仪和HPLC检测各组 荧光素钠的相对荧光强度，并计算荧光素钠的含量和包封率。这些都在本领域技术人员所 掌握的知识范围之内。
[0062] 下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，而 非限制性的。实施例中所用到的试剂及其用量、方法条件等，除非另有说明，否则都按制造 商的建议或按照本领域常规的做法实施。
[0063] 实施例
[0064] 1.材料与方法
[0065] I. 1细胞与主要试剂
[0066] 人肝癌细胞株H印G2细胞由本实验室传代保存；RNeasy Mini Kit购自QIAGEN公 司；Premix Ex Taq Version2. 0 购自 Takara 公司；FastDigest Xho I 和 FastDigest EcoR I 购自 ThermoFisher 公司；Mal-PEG2_-DSPE 和 mPEG2_-DSPE 购自美国 NANOCS 公司；大豆磷 脂酰胆碱DSPC S-100购自德国Lipoid公司；胆固醇（Cholesterol)和荧光素钠购自SIGM 公司；实验中所用多肽均委托杭州中肽生化有限公司合成。
[0067] I. 2!fepG2-NTCP细胞构建及鉴定
[0068] 从人肝组织提取总RNA，进行逆转录PCR，扩增NTCP编码序列；通过Xho I和EcoR I构建到PCMV载体，得到NTCP表达质粒pCMV-NTCP。在上述过程中，所用的PCR引物为 5' -CCCTCGAGAAAGAAGGCATCCAGCAA-3' 和 5' -GGAATTCGGTTAGAACT TCTGAAGTTTAATTC-3'。
[0069] 将质粒pCMV-NTCP和pCMV分别转染H印G2细胞，用终浓度1 μ g/ml嘌呤霉素 (puromycin)筛选得到稳定表达的细胞株H印G2-NTCP及对照H印G2-pCMV细胞。然后，分 别通过RT-PCR方法和FITC标记HBVpreS/lS-Sg 11^检测NTCP在H印G2-NTCP细胞中的表 达。RT-PCR检测中所用引物为上述构建NTCP表达载体实验中所用引物。在FITC标记 HBVpr eS/13-59myl:检测实验中，以FI TC标记的无关肽P印47-FI TC为对照，将多肽P印47 (SEQ ID N0:5) -FITC 和 HBVpreS/13-59胃"-FITC 分别与 H印G2-NTCP 和 H印G2-pCMV 细胞孵育 30 分钟后，进行流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测。
[0070] I. 3HBVpreS/13-32胃r-PEG2_-DSPE 的合成
[0071] 利用脱水缩合的方法在HBVpreS/13-32_的碳端偶联一个半胱氨酸，通过 其侧链的巯基与Mal-PEG2_-DSPE的末端基团马来酰亚胺共价结合(如图1示)，得到 HBVpreS/13-32myl:-PEG2(l(l(l-DSPE。具体方法为：将多肽 HBVpreS/13-32myl:溶于 PBS 溶液中 (ΡΗ=7· 0)，Mal-PEG2_-DSPE 溶于 DMF (二甲基甲酰胺），按 Mal-PEG2_-DSPE:HBVpreS/13 -32^=1:1.2物质的量比混合搅拌，4°C缓慢反应8小时。HPLC全程监测整个反应过程， MAIDI-T0F-MS鉴定反应产物。
[0072] 1.4荧光靶向纳米脂质体的制备
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