ppm/m2.min、1.87 ppm/m2.min。40 ppm 时，Cl 吸收的甲酸为30%，C3吸收的甲醛为22%，WT吸收的甲醛为17.5% ;三株烟草叶片总面积在0.175-0.185cm2。转基因烟草对气体甲醛的吸收效率仍显著高于野生型烟草，它们的平均甲醛吸收速率约为 2.22 ppm/m2.min、1.63 ppm/m2.min、1.3 ppm/m2.min ;这些结果表明 6?堪因在烟草中的过量表达可提高其对气体甲醛的吸收。
[0015]6、转基因烟草对甲醛的抗性检测
(I)可溶性糖和总蛋白含量的测定:10 ppm、20 ppm、40 ppm气体HCHO胁迫处理半小时后，野生型和转基因植株的可溶性总糖含量均随着处理浓度的上升而上升，其中Cl的总糖含量上升最为明显，且一直显著高于WT，C3也一直高于WT。WT可溶性总蛋白的含量相对于转基因植株呈现出显著性下降，转基因烟草可溶性糖的显著性上升说明了转基因植株对于HCHO胁迫的耐受性明显的强于野生型植株，而由于转基因植株对于HCHO胁迫的耐受性比较强，所以其总蛋白含量变化不大，反观野生型植株，其总蛋白含量出现的显著性下降，可能是由于HCHO胁迫导致了相关基因的表达有所下降，致使体内蛋白水平下降，HCHO胁迫也会促使一部分可溶性蛋白降解。
[0016](2)叶绿素含量的测定:在未处理时三株烟草叶绿素含量都没有明显的差异。在10,20,40 ppm处理半小时后，WT、Cl、C3总叶绿素含量都是下降，但野生型烟草叶绿素含量比C1、C3下降的要多。40ppm处理后，Cl、C3总叶绿素含量为WT的2.5倍和1.88倍；说明在烟草中过量表达拟南芥CAT基因能有效降低HCHO对植物的毒害作用，使得转基因烟草叶片能在较高浓度HCHO胁迫下保持较好的HCHO吸收能力。
[0017](3)过氧化氢(H202)、丙二醛(MDA)和羰基化蛋白(PC)含量的测定:10 ppm,20ppm,40 ppm气体HCHO胁迫处理半小时后，野生型和转基因植株的过氧化氢含量都随着处理浓度的上升而上升，其中野生型植株中上升的最为明显，最后约是C1、C3的1.42倍，1.14倍，说明高浓度HCHO处理后会导致烟草细胞受到的氧化损伤。比较植株丙二醛(MDA)含量可知，随着处理浓度的升高野生型植株中的MDA含量增长速度远大于转基因植株，最后分别为C1、C3的1.27倍，1.11倍；比较羰基化蛋白(PC)含量可知，随着处理浓度的升高WT中的PC含量增长显著，在40ppm处理后其PC含量明显高于转基因植株，分别为Cl、C3的1.31倍，1.23倍。说明HCHO胁迫会导致烟草中膜脂过氧化和蛋白质过氧化水平都显著性升高，但是通过在烟草叶片细胞中过量表达CAT基因能有效的降低这种氧化胁迫的发生。
[0018]以上实施例说明本发明的重组载体pK2-PrbcS-*T-U浓转基因植株中的应用可提高其对甲醛的吸收和抗性。
[0019]7、转基因植株对甲醛抗性机理的分析
(I)叶片蒸腾速率和气孔导度的测定:10 ppm、20 ppm、40ppm气体HCHO胁迫处理半小时后，WT、Cl、C3的蒸腾速率和氢泵活性都有显著的下降，在40ppm时表现的最显著，WT和Cl、C3相比较未处理时其蒸腾速率分别下降了 83%、64%、69%，气孔导度分别下降了 86%、64%、73%。结果说明，随着甲醛浓度的升高，转基因摇床的蒸腾作用和气孔导度的下降幅度都显著小于野生型摇床，表明在甲醛胁迫时，转基因烟草气孔对气体甲醛的耐受更强。
[0020](2) PM H+-ATPase 活性和氢泵活性的测定:10 ppm、20 ppm、40ppm 气体 HCHO 胁迫处理半小时后，WT、Cl、C3的PM H+-ATPase活性和氢泵活性都有所下降，但Cl、C3的PMH+-ATPase活性和氢泵活性始终高于WT，在40 ppm时，Cl、C3的PM H+-ATPase活性分别是WT的3倍、2.4倍，Cl、C3的氢泵活性分别是WT的2.5倍、1.78倍；结果说明，随着甲醛浓度的升高，WT吸收甲醛的能力与转基因植株的差距越来越大。表明转基因植株对甲醛的吸收和耐受均强于野生型，而PM H+-ATPase活性和氢泵活性可能是导致这一表现的原因。
[0021]本发明的优点和技术效果:普通植物对气体甲醛的吸收效率低且在甲醛胁迫下易受到损伤，本发明将构建的植物过表达载体pK2-PrbcS-*T-U7转入烟草，提高了烟草对气体甲醛的吸收和耐受，为利用基因工程手段提高植物对气体甲醛的吸收提供了新的策略和基因资源。
【附图说明】
[0022]图1是本发明pMD18T-CAT的克隆策略； 图2是本发明入门载体pENTR*-PrbcS-*T-U7的克隆策略；
图3是本发明植物表达载体pK2-PrbcS-*T-CAT的克隆策略；
图4是本发明以堪因在转基因烟草中插入和表达检测示意图；其中:图A:以堪因在转基因烟草基因组中整合情况检测，WT为野生型烟草，C1-C5为经抗生素筛选出的转基因烟草株系；图B:以堪因在转基因烟草中转录水平检测，WT为野生型烟草，C1-C5为转基因烟草；
图5为CAT转基因烟草中CAT比活力水平检测，WT为野生型烟草，Cl、C3、C5转基因烟草；
图6为过量表达拟南芥CAT烟草对1ppm气体HCHO的吸收曲线；
图7为过量表达拟南芥CAT烟草对20ppm气体HCHO的吸收曲线；
图8为过量表达拟南芥CAT烟草对40ppm气体HCHO的吸收曲线；
图9为气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草叶片可溶性总糖含量的变化情况；
图10为气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草叶片可溶性总蛋白含量的变化情况；
图11为气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草总叶绿素含量的变化情况；
图12为气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草叶片H2O2含量的变化情况；
图13为气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草叶片MDA含量的变化情况；
图14为气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草叶片PC含量的变化情况；
图15为气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草蒸腾速率的变化情况；
图16为气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草气孔导度的变化情况；
图17为气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草PM H+-ATPase活性的变化情况；
图18为未处理的WT和转基因烟草的氢泵活性；
图19为1ppm气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草的氢泵活性；
图20为20ppm气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草的氢泵活性；
图21为40ppm气体HCHO胁迫下WT和转基因烟草的氢泵活性。
【具体实施方式】
[0023]试剂与仪器:
试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、质粒提取试剂盒等为宝生物工程有限公司(大连)产品，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit购自Invitrogen公司。其余试剂均为国产分析纯。
[0024]仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
[0025]所有引物序列均在大连宝生物公司合成。
[0026]本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0027]实施例1:以堪因cDNA的PCR扩增及TA克隆
从GenBank中查找拟南芥以堪因的cDNA序列，并设计一对序列如下的引物:
上游引物 5’ GCatgc ATGGATCCTTACAAGTATCGTCCAG 3’(含有 5^1 位点)；
下游引物 5’ CTCGAG TTAGATGCTTGGTCTCACGTTCAGA 3’(含有通ol 位点) 上游引物5’端加GCATGC特征序列，并由此形成Sph\酶切位点；下游引物3’末端加XhoI酶切位点，以拟南芥第一链cDNA为模板扩增，得到以堪因的全长cDNA。
[0028]用TRIzoL Reagent (Invitrogen)从拟南芥{Arabidopsis thaliana)幼苗中提取总RNA，取植物嫩叶约0.lg，加入Iml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混勾，离心15min (12000rpm)，转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混勾室温放置10min，4°C离心10min( 12000rpm)，弃上清，沉淀用体积浓度75%乙醇Iml清洗，4°C离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 μ I焦碳酸二乙醋(DEPC)处理水溶解 RNA。使用 M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (TaKaRa)进行 cDNA 的合成，取植物总 RNA 约 0.1 μ g-5 μ g，oligo (dT) 50ng，1mM dNTP mix I μ 1，用DEPC处理水补足至10 μ 1，混勾后，短暂离心将之收集于管底，置于65°C加热5min，冰浴 lOmin，加入反应混合物 9 μ I (5Xreact1n buffer 4μ l,25mM MgCl2 4μ1，0.1Μ DTT2 μ 1，RNA酶抑制剂I μ 1)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25°C保温2min，加入I μ I M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混勾，短暂离心将之收集于管底，25°C保温20min，然