酶合成基因B1型突变位点。
[0028] 图2为利用高分辨率熔解曲线分析仪器进行突变位点检测结果；
[0029](其中，1，为B1突变型；2,为野生型；3,为杂合型）。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0031] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0032] 实施例1
[0033] 1)首先克隆出高油酸大豆B1和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lB基因序列 (NCBIID为100805777,大豆基因组数据库序列编号为：Glyma20g24530)，利用DNAstar软 件进行序列比对首次发现了位于409bp处的单碱基突变（序列比对结果见附图1)。同时， 提取待测样品的DNA。
[0034] 2)根据步骤1)中突变位点设计巢式PCR的外部上游引物B1-F和外部下游引物 B1-R(如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示），利用以待鉴定材料的基因组DNA作为模板进行 GmFAD2-lB突变位点的第一轮PCR，所采用的PCR反应体系（表1)及扩增程序如下：
[0035] 表1第一轮PCR反应的扩增体系
[0036]
[0037] PCR扩增条件为：94°C预变性4min，94°C变性40s，56°C退火30s，72°C延伸15s，共 35个循环，再72°C延伸4min，4°C保温。
[0038] 3)根据步骤1)中突变位点设计巢式PCR的内部上游引物B1-内-BAY-F，B1-内-F 和内部下游引物B1-内-R(如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 5所示），以步骤2)中第一轮所得 PCR产物稀释10倍后为模板，进行第二轮保证特异性的PCR扩增，其中PCR反应体系（表 2)及扩增条件如下：
[0040] 表2第二轮PCR扩增反应体系
[0041] ?0?扩增条件为：94°0预变性4!^11，941：变性4〇8,56.81：退火3〇8,721：延伸1〇8， 共15个循环，再72°C延伸4min，4°C保温。
[0042] 4)将步骤3)中第二轮PCR所得的PCR产物用20矿物油覆盖成混合样品，并将该 混合样品转移至高分辨率熔解曲线分析仪器专用96孔板中，进行基因型突变检测。
[0043] 5)根据步骤4)的GmFAD-2-lB(大豆脂肪酸脱氢酶合成基因）B1型突变位点类型 检测结果如附图2所示。其中，曲线1(左峰）为A3型突变体，曲线2(右峰）为野生型，曲 线3(中间）为杂合型。
[0044] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此 技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保 护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因BI型突变的引物组，其特征在于，核苷酸 如 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 5 所示。2. -种利用权利要求1所述引物组检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因Bl型突变的方 法，其特征在于，是以待测样品的DNA为模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所述序列为 引物进行第一轮PCR扩增，稀释扩增产物后，再以稀释后的扩增产物为模板，以如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 5所述序列为引物进行第二轮PCR扩增，最后利用高分辨率熔解曲线分析 仪器对第二轮扩增产物进行基因型突变检测。3. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 提取待鉴定材料的DNA ; 2) 以步骤1)所得的DNA为模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所述序列为引物进行 第一轮PCR巢式扩增，获得扩增产物后，进行稀释处理； 3) 以步骤2)中稀释后的扩增产物为模板，以如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 5所述序列为 引物进行第二轮巢式PCR扩增，扩增结束后获得第二轮扩增产物； 4) 利用20矿物油将步骤3)所得的第二轮扩增产物覆盖成混合样品，再利用高分辨率 熔解曲线分析仪器对第二轮扩增产物的基因型突变进行检测。4. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤2)所述第一轮巢式PCR扩增，扩增条件为： 94°〇预变性4!^11，941：变性4〇8,561：退火3〇8,721：延伸158，共35个循环，再721：延伸 4min，4°C保温；所述稀释处理，是利用ddH 20稀释10倍。5. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3)所述第二轮巢式PCR扩增，扩增条件为： 94°C预变性4min，94°C变性40s，56. 8°C退火30s，72°C延伸10s，共15个循环，再72°C延伸 4min，4°C 保温。6. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤4)所述利用高分辨率熔解曲线分析仪器对 第二轮扩增产物的基因型突变进行检测，是根据目标片段的GC含量的变化在不同熔解温 度出现吸收峰的位置判定，突变株的GC含量下降，熔解温度降低，吸收峰在左侧；野生型GC 含量增加，熔解温度升高，吸收峰在右侧；杂合型的GC含量居中，吸收峰位于中间温度。7. 权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 提取待鉴定材料的DNA ; 2) 以步骤1)所得的DNA为模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所述序列为引物进行 第一轮PCR巢式扩增，扩增条件为：94°C预变性4min，94°C变性40s，56°C退火30s，72°C延 伸15s，共35个循环，再72°C延伸4min，4°C保温；所述稀释处理，是利用ddH 20稀释10倍； 3) 以步骤2)中稀释后的扩增产物为模板，以如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 5所述序列 为引物进行第二轮巢式PCR扩增，扩增条件为：94°C预变性4min，94°C变性40s，56.8°C退火 30s，72°C延伸10s，共15个循环，再72°C延伸4min，4°C保温，扩增结束后获得第二轮扩增产 物； 4) 利用20矿物油将步骤3)所得的第二轮扩增产物覆盖成混合样品，再利用高分辨率 熔解曲线分析仪器对第二轮扩增产物的基因型突变进行检测，并将所得熔解曲线与野生型 和杂合型样品的熔解曲线进行对比，当待测样品的熔解温度降低，熔解曲线位于野生型和 杂合型样品的左侧时，该待测样品即为Bl型突变株。8. 权利要求3-7所述任一方法，其特征在于，用于大豆的遗传育种。9. 利用权利要求1所述引物组制备的检测试剂盒。10. 权利要求9所述试剂盒，其特征在于，用于筛选和鉴定大豆脂肪酸脱氢酶合成基因 Bl型突变体。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变的引物组及应用，属于植物分子标记开发和作物分子辅助选择技术领域。本发明所提供引物组的核苷酸序列表如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示。同时本发明还提供了一种利用上述引物组快速检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变位点的方法，该方法是以待测样品的DNA为模板，以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所述序列为引物进行第一轮PCR扩增，稀释扩增产物后，再以稀释后的扩增产物为模板，以如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5所述序列为引物进行第二轮PCR扩增，最后利用高分辨率熔解曲线分析仪器对第二轮扩增产物进行基因型突变检测。本发明所提供的引物和方法对于高油酸大豆的分子标记辅助选择具有重要意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104962631
【申请号】CN201510386064
【发明人】任航, 南海洋, 张倩
【申请人】黑龙江富航农业科技有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月30日