重组抗her2/ps双特异性抗体、其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明公开了一种重组双特异性抗体、其制备方 法和其在抗实体瘤上的作用。
【背景技术】
[0002] 细胞凋亡是机体中的一个受严格调控的程序，高效清除凋亡细胞是免疫耐受的基 础。在凋亡过程中，处于正常细胞的细胞膜内表层的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine， PS)翻转至细胞膜外表层。M2型巨噬细胞利用细胞表面PS受体识别此信号从而吞噬 凋亡小体，同时，释放肿瘤生长因子（tumor growth factor，TGF)-0,白细胞介素-10 (interlukinlO, IL-10)等炎症抑制因子介导一系列免疫抑制程序[Gabrilovich D等， Nature Review Immunology. 2009, 9:162-174]。近年来，人们发现肿瘤血管上皮细胞、肿 瘤来源的外来体以及处于肿瘤微环境中的肿瘤细胞也存在PS的外翻，并且这种外翻在接 受化疗或放疗后更加明显。这些PS外翻的肿瘤细胞同样通过增强肿瘤微环境中的巨噬细 胞向具有免疫抑制功能的M2型巨噬细胞分化，抑制具有强大细胞杀伤能力的Ml型巨噬细 胞生成从而促进肿瘤生长[Ran S 等，Clinical Cancer Research.2005, 11:1551-1562]。 研究表明，特异性针对人PS的单克隆抗体Bavituximab (美国Peregrine公开开发，CAS NO. 648904-28-3)通过多种不同的机制抑制了肿瘤的生长：1)利用抗体依赖的细胞介导 的毒性作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC)直接杀伤表达 PS的肿瘤来源细胞，尤其是肿瘤血管上皮细胞；2)阻断M2型巨噬细胞对PS的识别，抑制 肿瘤微环境中免疫抑制策略的发展从而促进Ml型肿瘤杀伤巨噬细胞的活化，清除肿瘤 细胞[Huang X 等，Cancer Research. 2005, 65:4408-4416]。Bavituximab 在与多西他赛 (Docetaxel)联合用药的非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma, NSCLC)二期临 床中显示了极好的疗效，相比于多西他赛，中位总生存期提高了 4. 3个月，基于此数据，美 国FDA将其纳入快速通道。同时，在乳腺癌的二线治疗中Bavituximab与多西他赛的联用 将患者中位总生存期从多西他赛单药的11. 4个月提高到21. 7个月。
[0003] 约20%~25%的乳腺癌患者存在人类表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor，HER2)基因扩增或蛋白过量表达[Jahanzeb M 等，Clinical Breast Cancer. 2008,8:324-333]。抗 HER2 单克隆抗体 Trastuzumab (商品名：Herceptin) 从1998年上市至今，一直高居单抗药物销量前五。通过直接杀伤HER2高表达的 乳腺癌细胞，Trastuzumab显著改善肿瘤患者的预后[White C等，Annual Review Medicine. 2001，52:125-145]。但是在此过程中，不可避免地由于死细胞和凋亡细胞呈现大 量的细胞表面PS，肿瘤耐受型免疫应答被诱导。因此，构建一个可以同时特异性结合HER2 与PS两个靶点的双特异性抗体，实现在直接杀伤细胞表面HER2或PS阳性的肿瘤细胞的同 时，还抑制随后肿瘤免疫耐受的发生，阻断肿瘤免疫逃逸通路，一直是本领域的技术人员急 待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，得到了一个可以同时阻断 HER2与PS两个靶点的双特异性抗体，即本发明所述的"重组抗HER2/PS双特异性抗体"，从 而完成了本发明。
[0005] 本发明公开了 ：
[0006] 1. 一种重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于所述抗体既能与HER2结合，还 能与PS结合。
[0007] 2.上述重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于，所述重组抗HER2/PS双特异性 抗体可变区氨基酸序列包含抗HER2单克隆抗体的可变区和抗PS单克隆抗体可变区氨基酸 序列。
[0008] 3.上述重组抗HER2/PS双特异性抗体，所述双特异性抗体重链可变区氨基酸序列 如SEQ ID NO:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0009] 4.本发明所提供的重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗 体重链氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0010] 5. -种分离的核酸分子，其编码上述1-4任一所述抗HER2/PS双特异性抗体。优 选地，所述核酸分子重链核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
[0011] 6. -种载体，其含有上述5所述的核酸分子，所述载体可以为pDRl，pcDNA3· 1( + )， pDHFF 及 pCHOl. 0 之一，优选 pCHOl. 0。
[0012] 7. -种宿主细胞，其含有上述6所述的载体，优选地，所述细胞为真核细胞，更优 选地，所述细胞为哺乳动物细胞，最优选地，所述细胞为中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO)细胞。
[0013] 8. -种制备上述抗HER2/PS双特异性抗体的方法，该方法包括：
[0014] a)在表达条件下，培养上述7所述的宿主细胞，从而表达抗HER2/PS双特异性抗 体；
[0015] b)分离或纯化a)的抗HER2/PS双特异性抗体。
[0016] 9.上述抗HER2/PS双特异性抗体制备方法，包括以下步骤：
[0017] a)构建抗HER2/PS双特异性抗体的重链融合基因和轻链融合基因；
[0018] b)将上述a)融合基因克隆到载体pCHOl. 0,构建表达载体pCHOl. 0 (anti-HER2/ PS)；
[0019] 〇)将上述13)的？0101.0(&拉丨-册1?2/^)表达载体转染010细胞，筛选，进行亚克 隆，将筛选得到的高表达克隆进行扩大培养，表达抗HER2/PS双特异性抗体；
[0020] d)分离或纯化c)所述抗HER2/PS双特异性抗体。
[0021] 10. -种组合物，含有上述1-4任一所述的抗体和药学上可接受的载体。
[0022] 11.上述1-4任一所述的抗HER2/PS双特异性抗体或上述10所述组合物在制备抗 肿瘤药物中的用途。
[0023] 12.上述11所述用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。
[0024] 本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pDHFF及 pCHOl. 0 (如图2)之一,表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序 列。
[0025] 本发明中，可用的宿主细胞为含有上述载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物 或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达，C0S，CH0，NS0, sf9及sf21 等均可适用于本发明；也可以为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21 (DE3)，TGl之 〇
[0026] 本发明中公开的抗HER2/PS双特异性抗体的制备方法为在表达条件下，培养上述 的宿主细胞，从而表达抗HER2/PS双特异性抗体；分离或纯化所述的抗HER2/PS双特异性抗 体。利用上述方法，可以将融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单 一条带。
[0027] 可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的 亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上 的融合蛋白多肽。
[0028] 本发明公开的上述抗HER2/PS双特异性抗体是通过以下方法得到的：抗HER2抗体 Trastuzumab(IgGl, κ )的八序列与Vh序列分别通过不同接头短肽（例如：ASTKGP ;TVAAP) 与抗PS抗体Bavituximab (IgGl, κ )的N端相连接。更具体地，本发明的申请人通过大量 实验，首先分别表达了抗HER2抗体的Vh和\片段基因，及抗PS抗体的重链和轻链全长基 因。在此基础上利用Overlap PCR将Vh片段通过连接短肽与抗PS抗体的重链连接，'片段 通过另一连接短肽与抗PS抗体的轻链连接，然后进一步将上述融合后的轻链和重链基因 克隆到真核表达载体pCHOl.O (购自：Life Technology)中，构建成真核表达载体pCHOl.O (anti-HER2/PS)。将此表达载体通过脂质体法转染CHO细胞，然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤 筛选阳性细胞克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲 和柱分离或纯化抗HER2/PS双特异性抗体。
[0029] 本发明的申请人对上述的抗HER2/PS双特异性抗体进行了体外、体内生物学实 验。体外生物学实验结果表明此抗体能很好地与HER2和/或PS同时结合。抗HER2/PS双 特异性抗体在小鼠体内的血浆半衰期为6. 3天，表明本发明的抗HER2/PS双特异性抗体的 结构高度稳定。
[0030] 本发明的申请人对上述的抗HER2/PS双特异性抗体进行亲和力检测、HER2或 PS革E标介导的抗体依赖的细胞介导的毒性作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC)、蛋白药代动力学实验、体内抑瘤等实验，实验结果表明，本发明公开 的抗HER2/PS双特异性抗体可以同时结合细胞膜表面HER2和PS，阻断两者的信号传导通 路。一方面，本发明的抗HER2/PS双特异性抗体强大的ADCC效应介导了对高表达HER2或 细胞表面PS的肿瘤细胞的直接杀伤；另一方面，该抗HER2/PS双特异性抗体