通过中和细胞 死亡过程中持续呈现的外翻PS，阻止其与M2巨噬细胞表面PS受体结合，阻断了细胞死 亡程序对抑制型免疫反应的诱导，抵制了肿瘤免疫逃逸的发生。此外，本发明的抗HER2/ PS双特异性抗体比Trastuzumab或Bavituximab具有更大的分子量，其半衰期明显延长， 实验表明，在相等剂量下，本发明的抗HER2/PS双特异性抗体比单独应用Trastuzumab或 Bavituximab具有更好的抗肿瘤治疗效果。
[0031] 本发明公开上述抗HER2/PS双特异性抗体，可以和药学上可以接受的载体一起组 成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗HER2/PS双 特异性抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解 (包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2°C -8°C条件 下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30°C至少六个月保持稳定。所述抗HER2/PS双特异 性抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发 明公开的上述抗HER2/PS双特异性抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括但 不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包 括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80) ;p〇l〇xamer(如poloxamerl88) ;Triton ;十二烷基硫酸钠（SDS);月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八 烷基肌氨酸；Pluronics ;MONAQUAT?等，其加入量应使抗HER2/PS双特异性抗体的颗粒化趋 势最小。溶液稳定剂包括但不限于以下列举之一或其组合：糖类，例如，还原性糖和非还原 性糖；氨基酸类，例如，谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙 二醇等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的 时间内保持稳定状态。等渗调节剂包括但不限于氯化钠、甘露醇之一或其组合。缓冲液包 括但不限于：TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一或其组合。
[0032] 上述制剂为包含抗HER2/PS双特异性抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药 后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。
[0033] 本发明所指的肿瘤，包括但不限于：腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤 组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、 肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子 宫。除了上述的肿瘤外,还可用于中枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等， 此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内 分泌系统肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿瘤，生殖系统肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一 列举。优选乳腺癌。
[0034] 本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿 瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿 瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止转移。
[0035] 本发明中抗HER2/PS双特异性抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给 药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的 结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1~ISOOmg/天。
[0036] 本发明公开的抗HER2/PS双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联 合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括但不限于：1、细胞毒类药物（1)作用于DNA化 学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；钼类化合物如顺钼、卡钼和草 酸钼等；丝裂霉素（MMC) ; (2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤 (MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类（5FU、FT - 207、卡培他滨)等；嘌 呤核苷合成酶抑制剂如6 -巯基嘌呤（6 - MP)和6 - TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基 脲（HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷（Ara-C)和健择（Gemz)等；（3)作用于核酸转录的 药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线 菌素 D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；（4)主要作用于微管蛋白合 成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼白硷类、高三尖杉酯碱；（5)其他细胞毒 药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美 坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激 动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干 扰素；白细胞介素一 2 ;胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华（MabThera) ;CetuXimab(C225); Bevacizumab(Avastin) ;5、其他包括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分 化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的抗HER2/PS双特异性抗体及其组合物 可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。
【附图说明】
[0037] 图1抗HER2/PS双特异性抗体结构示意图
[0038] 图2 pCHOl. 0结构示意图
[0039] 图3抗HER2/PS双特异性抗体针对与HER2结合力实验结果
[0040] 图4抗HER2/PS双特异性抗体与PS的结合力实验结果
[0041] 图5抗HER2/PS双特异性抗体针对HER2靶抗原的ADCC效应实验结果
[0042] 图6抗HER2/PS双特异性抗体体内抑制BT-474生长的活性实验结果
【具体实施方式】
[0043] 以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限 制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋 白的基因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对 于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括 Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniais, T. (1989) Molecular Cloning ：A Laboratory Manual,2nd edition, Cold spring Harbor Laboratory Press.
[0044] 实施例1抗HER2/PS双特异性抗体的基因构建与表达
[0045] 抗人HER2单克隆抗体Trastuzumab (IgGl，κ )的序列来自于KEGG基因库 (NO. D03257)，比对人IgGl抗体的恒定区序列分析获得VH和VL基因片段。同时，根 据who. int公布的抗人PS单克隆抗体Bavituximab (IgGl，κ )氨基酸序列（WHO Drug Information, Vol. 21，No. 1，2007. p7)，经过密码子优化后由生工生物工程有限公司全基因 合成核苷酸序列。采用Overlapping PCR的方法将Trastuzumab的VH基因片段通过接头 (ASTKGP)与Bavituximab重链的N端融合；将VL基因片段通过接头（TVAAP)与Bavituximab 轻链的N端融合。接头片段分别来自于人IgGlCHl或C κ的N端序列。重链Overlapping PCR 的引物为（有义引物 I :GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGG ;反义引物 I :CTCTGCTGCAGCTGCACTTCCG GGCCTTTGGTGCTCGCCACCAGGGTGCCCTGGCCCCAATAA ;有义引物 2 :GGGGCCAGGGCACCCTGGTGGCGA GCACCAAAGGCCCGGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCC ;反义引物 2 :TTTGCCCGGGCTCAGGCTCAGGC)。 轻链Overlapping PCR的引物为（有义引物I :GATATTCAGATGACCCAGAGCCC ;反义引物 1 : CTCTGGGTCATCTGAATATCCGGCGCCGCCACGGTCACTTTGGTGCCCTGGCCAAAGGTC ;有义引物 2 :TTGGCCAGGGCACCAAAGTGACCGTGGCGGCGCCGGATATTCAGATGACCCAGAGCCCGA ;反义引物 2 : GCATTCGCCGCGGTTAAAGCTTT)。SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:1、SEQIDN0:6分别显 示了所得抗PS/HER2双特异性抗体重链核苷酸序列、重链氨基酸序列和重链可变区氨基酸 序列；SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5分别显示了所得抗PS/HER2双特异抗体的轻 链核苷酸序列、轻链氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列。附图1展示了抗HER2/PS双特异 性抗体结构示意图(其中，VHl为原Trastuzumab重链可变区序列，VH2为原Bavituximab的 重链可变区序列，CH1-CH2-CH3为原Bavituximab的重链恒定区序列，VLl为原Trastuzumab 轻链可变区序列，VL2为原Bavituximab的轻链可变区序列，CL为原Bavituximab的轻链 恒定区序列)。将PCR产物克隆到pCHOl.O表达载体(购自Life technologies公司），测序 验证确认获得了正确的克隆，正确的克隆载体表示为：pCHOl.O (anti-HER2/PS)。另外，人 HER2基因 （NM_001005862. 2)常规加上人IgGlFc序列后由生工生物工程有限公司合成，用 同样的方法分别将HER2_Fc，Trastuzumab和Bavituximab全基因克隆到pCHOl. 0中，正确 的克隆载体分别标记为 pCHOl.O (anti-HER2)与 pCHOl.O (anti-PS)。